一種高純度膠原蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質的制備領域，具體涉及一種高純度膠原蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002] 膠原蛋白是一種纖維蛋白（fibrous protein)，其可在軟骨、筋腱、真皮組織以及 其它結締組織中發現。
[0003] 目前，膠原蛋白已廣泛運用于工業以及醫藥，它一般藉由可將非膠原蛋白物質移 除的反復酸溶或酵素處理，而由結締組織純化出來;此種處理需重復數次以改善膠原蛋白 的純度。重復處理不僅會拉長純化工藝，更會導致膠原蛋白產率低。公開號為CN 102131403A的中國發明專利公開了一種新穎的膠原蛋白制備方法，通過先制造膠原蛋白基 質，然后再由基質萃取出膠原蛋白，這種方法避免了制備過程中的重復操作，然而造膠原蛋 的純度仍有改善空間。
【發明內容】
[0004] 本發明目的是為了克服現有技術的不足而提供一種高純度膠原蛋白的制備方法。
[0005] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種高純度膠原蛋白的制備方法，它 依次包括以下步驟：
[0006] (a)選取動物身上的結締組織；
[0007] (b)將所述結締組織浸入第一酸液中，使其體積至少膨脹一倍形成膨脹結締組織；
[0008] (c)清洗所述膨脹結締組織，形成膠原蛋白基質；
[0009] (d)利用萃取液從所述膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白，形成含有膠原蛋白的溶液；
[0010] (e)將所述含有膠原蛋白的溶液傾入鹽溶液中，得到膠原蛋白沉淀；
[0011] (f)將所述膠原蛋白沉淀置于透析袋內放入清水中進行透析，取出干燥即可。
[0012] 優化地，步驟(c)中，采用清洗液對所述膨脹結締組織進行清洗，所述清洗液中包 含以下重量份數的原料： 水 100~150份：
[0013] 表面活性劑 1~10份； 螯合劑 1~10份； 蛋白水解酶 1~10份;
[0014] 1-甲基-3-乙基咪唑氯鑰鹽 0,1~1份； 氯化鈉 1~5份。
[0015] 優化地，所述步驟(a)中，采用人工或機械清理結締組織除去脂肪和脂質。
[0016] 優化地，步驟(b)中，所述第一酸液中包含甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸和蘋果酸 中的一種和多種，其濃度為0.5~3mol/L。
[0017] 優化地，步驟⑷中，所述萃取液包含有機弱酸或/和無機鹽的溶液，其pH值為3~ 7〇
[0018] 優化地，步驟(e)中，所述鹽溶液的濃度為0.3~2mol/L，其體積與所述含有膠原蛋 白的溶液體積比為5~10:1。
[0019] 優化地，步驟(f)中，所述清水每30~60分鐘更換一次，透析時間為3~5小時。
[0020] 由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：本發明高純度膠 原蛋白的制備方法，通過將含有膠原蛋白的溶液傾入鹽溶液中沉淀并進行透析，這樣能夠 得到高純度膠原蛋白；并且采用特定的清洗劑，能夠提高得到的膠原蛋白基質純度，從而為 得到高純度膠原蛋白打下基礎。
【具體實施方式】
[0021] 本發明高純度膠原蛋白的制備方法，它依次包括以下步驟：（a)選取動物身上的結 締組織，結締組織選取的表面積為20平方毫米(mm 2)至2平方米(m2);起始材料（即結締組織） 取自于動物，例如牛、豬、馬、羊、雞、鴨、火雞、鵝、鯨魚或者鯊魚等畜類或魚類，具體部位為 真皮組織、皮下組織、韌帶、筋腱、腱膜、軟骨以及骨頭組織等;在取用時可先用人工切開或 機械清理結締組織以除去不需要的材料，例如脂肪及脂質。如將動物皮除去脂質、以鹽水清 洗皮數次后，以一植皮刀除去動物皮的表面層即可獲得真皮組織，所得的真皮組織可用磷 酸鹽緩沖溶液進一步清洗。根據需要，結締組織可以先用適合的有機溶劑(如醇、酮、丙酮、 乙腈、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或其混合物)或者有機溶劑與水的混合液(其體積 比為1:1~5)進行處理，使有機溶劑可以滲透入結締組織；當結締組織含有毛發或毛根時， 可以用微堿溶液或蛋白水解酶處理以除去毛發或毛根，蛋白水解酶可為分散酶、胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鳳梨蛋白酶、無花果蛋白酶或其混合物。
[0022] (b)將所述結締組織浸入第一酸液中，使其體積至少膨脹一倍形成膨脹結締組織； 第一酸液為有機酸，例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸或其混合物，其濃度為0.5 ~3mol/L;醋酸效果較佳;為了獲得較佳的膨脹效果，可以在其中加入清洗液中含有的表面 活性劑，使其濃度為〇. 1~〇. 5mol/L。
[0023] (c)清洗所述膨脹結締組織，形成膠原蛋白基質;步驟(c)中，采用清洗液對所述膨 脹結締組織進行清洗，所述清洗液中包含以下重量份數的原料:水100~150份、表面活性劑 1~10份、螯合劑1~10份、蛋白水解酶1~10份、1 -甲基-3-乙基咪唑氯鐵鹽0.1~1份和氯化 鈉1~5份，以得到高純度膠原蛋白基質。表面活性劑選用常規的即可，如十二烷基硫酸鈉 (SDS)、Tego化合物、氯化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基銨等；螯合劑選用常規的即 可，如乙二胺四乙酸化0了六）、1，4,7，10-四氮雜環十二烷基-1，4,7，10'-四乙酸(0(^4)、1，4， 7，10-四氮雜環十二烷基_1，4,7，10'-四亞甲基磷酸(0(^)等。蛋白水解酶可以采用無花果 蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶以及溶血素，以除去連接于細胞外基質的蛋白質、其它 非膠原蛋白的蛋白質與膠原蛋白分子的末端肽。
[0024] (d)利用萃取液從所述膠原蛋白基質萃取出膠原蛋白，形成含有膠原蛋白的溶液； 可以將前述的膠原蛋白基質進行研磨、震蕩、攪拌、均質化、絞碎、撕裂、切割、磨碎、切或其 混合方式使其有利于在萃取液中的溶解;隨后將處理過的膠原蛋白基質浸于萃取液中，并 對其進行震蕩、攪動或攪拌使得萃取液能夠溶解最大量的膠原蛋白，過濾除去未溶解的部 分;該萃取液包含有機弱酸或/和無機鹽的溶液，其pH值為3~7;弱酸為甲酸、草酸、醋酸、檸 檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其混合物;無機鹽包含氯化鈉或/和氯化鉀，其濃度為0.1 ~2mol/L〇
[0025] (e)將所述含有膠原蛋白的溶液傾入鹽(也是氯化鈉或/和氯化鉀)溶液中，得到膠 原蛋白沉淀;鹽溶液的濃度為0.3~2mol/L，其體積與含有膠原蛋白的溶液體積比為5~10: 1〇
[0026] (f)將所述膠原蛋白沉淀置于透析袋內放入清水中進行透析3~5小時，取出干燥 即可;清水每30~60分鐘更換一次。
[0027] 下面將結合實施例對本發明進行進一步說明。
[0028] 實施例1
[0029] 本實施例提供一種高純度膠原蛋白的制備方法，它依次包括以下步驟：
[0030] (a)自豬身上取得皮膚組織，除去脂質后，以鹽水清洗皮數次，以植皮刀除去皮的 表皮層以獲得厚度為〇. 3_的真皮組織;隨后用磷酸鹽緩沖溶液清洗該真皮組織，將緩沖溶 液殘余物自真皮組織的表面完全的除去；
[0031] (b)將上面的真皮組織浸入盛有濃度為0.5mol/L的醋酸溶液的容器內，在40°C恒 溫放置48h使真皮組織膨脹至厚度為0.6毫米；
[0032] (c)用清洗液清洗膨脹結締組織，該清洗液中包含以下重量份數的原料:水100份、 表面活性劑1份、螯合劑1份、蛋白水解酶1份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鑰鹽0.1份和氯化鈉1 份;從而形成膠原蛋白基質；
[0033] (d)將膠