一種制備人凝血因子viii的離子交換層析用洗滌緩沖液及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于血液制品領域，具體涉及一種制備人凝血因子VIII的離子交換層析用 洗滌緩沖液及其用途。
【背景技術】
[0002] 人凝血因子VIII(Human coagulation factorVDI，FVni)是一種重要的內源性凝血 因子，FVIII缺乏會導致嚴重的遺傳性出血性疾病-甲型血友病。甲型血友病是最常見、發病率 最高的凝血因子缺陷病，最有效的治療方法就是給患者輸注富含FVIII的血漿制品，達到預防 和治療的目的。因此，FVIII是甲型血友病患者的救命藥。
[0003] FVI是以健康人血漿為原料，經分離、提純，并經病毒去除和滅活處理、凍干制成。 《中國藥典》2015版規定，人凝血因子VIII的比活性為每lmg蛋白質應不低于10.0IU，可見異 物除允許有微量細小蛋白顆粒外，其余應符合規定。
[0004] 制備FVI常用的方法有沉淀法和層析法，沉淀法包括等電點沉淀，鹽析沉淀，醚沉 淀，酸沉淀和PEG沉淀等，層析法包括離子交換層析，親和層析等。其中，離子交換層析法用 于制備FVIII具有純度較高，重現性好，成本相對較低的優點，為國內外大多數廠家所采用。
[0005] FVIII分子量大、結構復雜，易失活，而且由于使用時需直接注射人體，對產品的可見 異物要求嚴格，因此對FVIII制備工藝的要求較高。采用現有工藝制備FVI時，對活性損失較 大，尤其是經80°C下，72小時干熱處理后，活性損失嚴重；同時很難保證產品中的可見異物 合格。
[0006] 目前的制備工藝通常是在FVI最終配制時加入含白蛋白或糖醇或成分復雜的保護 劑，以保證產品的較高活性收率和可見異物合格，但是效果不夠理想，而且造成成本升高。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種制備人凝血因子VIII的離子交換層析用洗滌緩沖液及制備FVIII 的方法。
[0008] 本發明提供了一種制備人凝血因子VIII的離子交換層析用洗滌緩沖液，它含有終 濃度為〇. 121-0.129M的氯化鈉。
[0009] M:即mol/L〇
[0010] 進一步地，它含有終濃度為0.125M的氯化鈉。
[0011] 其中，所述洗滌緩沖液包括如下配比的組分：
[0012] 氯化鈉 0.121-0.129M，枸櫞酸鈉 0.005-0.015M，氯化鈣0.0005-0.0015M，甘氨酸 0 · 116-0.126M，鹽酸賴氨酸 0· 011-0.021M。
[0013] 進一步地，所述洗滌緩沖液包括如下配比的組分：
[0014] 氯化鈉0.125M，枸櫞酸鈉0.01M，氯化鈣0.001M，甘氨酸0.121M，鹽酸賴氨酸 0.016M〇
[0015]其中，所述洗滌緩沖液的pH值為6.5-7.5。
[0016]進一步地，所述洗滌緩沖液的pH值為6.95-7.05。
[0017]更進一步地，所述洗滌緩沖液的pH值為7.0。
[0018] 本發明還提供了上述洗滌緩沖液在制備人凝血因子VIII中的用途。
[0019] 本發明提供了一種制備人凝血因子VIII的聯合用離子交換層析緩沖液，它包括平 衡緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液；
[0020] 所述洗滌緩沖液為上述洗滌緩沖液；
[0021] 所述平衡緩沖液包括如下配比的組分：氯化鈉0.06-0.16M，枸櫞酸鈉0.005_ 0.015M，氯化鈣0.0005-0.0015M，甘氨酸0.116-0.126M，鹽酸賴氨酸0.011-0.021M;
[0022] 所述洗脫緩沖液包括如下配比的組分：氯化鈉0.25-0.35M，枸櫞酸鈉0.005-0 · 015M，氯化鈣0 · 0005-0 · 0015M，甘氨酸0 · 116-0 · 126M，鹽酸賴氨酸0 · 011-0 · 021M。
[0023] 進一步地，所述平衡緩沖液包括如下配比的組分:氯化鈉0.11M，枸櫞酸鈉0.01M， 氯化鈣0.001M，甘氨酸0.121M，鹽酸賴氨酸0.016M;
[0024]所述洗脫緩沖液包括如下配比的組分：氯化鈉0.3M，枸櫞酸鈉0.01M，氯化鈣 0.001M，甘氨酸0.121M，鹽酸賴氨酸0.016M。
[0025]其中，所述平衡緩沖液、洗脫緩沖液的pH值為6.5-7.5。
[0026]進一步地，所述平衡緩沖液、洗脫緩沖液的pH值為6.95-7.05。
[0027] 更進一步地，所述平衡緩沖液、洗脫緩沖液的pH值為7.0。
[0028] 本發明還提供了一種制備人凝血因子VIII的方法，它包括如下步驟：
[0029] (1)取血漿，制備冷沉淀，溶解冷沉淀，樣品預純化，有機溶劑/去污劑結合法滅活 病毒，得待上柱樣品；
[0030] (2)離子交換層析：以Toyopearl DEAE 650M凝膠為層析柱填料；
[0031]將步驟（1)得到的待上柱樣品上層析柱，分別使用平衡緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫 緩沖液通過層析柱，收集得到含人凝血因子珊的洗脫液；
[0032]其中，平衡緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液如上述所示；
[0033] (3)對步驟(2)得到的洗脫液超濾，凍干、干熱處理，既可。
[0034] 其中，
[0035] 步驟(1)中，所述樣品預純化采用聚乙二醇沉淀和氫氧化鋁吸附結合的方式;所述 有機溶劑/去污劑為聚山梨酯80/磷酸三丁酯，所述滅活病毒的條件為:25 ± 1°C下，6小時； [0036]步驟(2)中，所有緩沖液的層析流速均為lOOcm/h;
[0037] 步驟(3)中，干熱處理的條件為:80°C下，72小時。
[0038] 本發明還提供了上述方法制備得到的人凝血因子VIII。
[0039] 目前常用的離子交換層析用洗滌緩沖液的離子濃度為氯化鈉0.15M。本發明人在 研究中意外地發現，洗滌緩沖液的離子強度對FVIII的活性收率與可見異物影響很大，在洗滌 緩沖液中氯化鈉的終濃度為〇. 121 -0.129M時，即可以很好的維持FVI的較高活性收率與無 絮狀物，可見異物合格，而離子強度太低，FVI的雜蛋白增多，容易出現絮狀物;離子強度過 高，FVIII穩定性差，FVIII中間品和成品的活性收率急需下降，蛋白被激活，也容易出現絮狀物。
[0040] 本發明提供的用于制備人凝血因子VIII的離子交換層析用洗滌緩沖液，通過控制 氯化鈉的終濃度為0.121-0.129M，能較好的維持FVI制品的質量，包括活性、純度和可見異 物。使用本發明的洗滌緩沖液和純化方法，制備的FVIII中間樣品的活性收率高、純度高，無絮 狀物出現;成品的復溶性能好，活性收率高、純度高，穩定性好，可見異物合格;而且本發明 的洗滌緩沖液配方簡單、成本低廉，具有良好的工業應用前景。
[0041] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0042] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0043]圖1為FVI的制備流程圖。
【具體實施方式】
[0044]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照試劑盒 說明書選擇。
[0045] 實驗試劑:枸橡酸鈉，氯化媽，氯化鈉，甘氨酸，鹽酸賴氨酸，Toyopearl DEAE 650M 凝膠均為市售品。
[0046] 實施例1本發明人凝血因子VIII的制備
[0047] 本發明人凝血因子VIII的制備流程見圖1。
[0048]制備方法具體如下：
[0049] I、層析前處理
[0050] (1)以新鮮冰凍血漿為原料，經血漿融化，離心制備冷沉淀，0.02MTri s緩沖液溶解 冷沉淀，后經30 %聚乙二醇沉淀，氫氧化鋁吸附后離心，得上清；
[0051 ] (2)上清經過0.45μπι澄清過濾后，加入Tween-80 (即聚山梨酯80)和磷酸三丁酯使 其最終濃度分別為1%和0.3%，251±1°〇處理6小時，完成第一次病毒滅活（8卩30病毒滅 活），得待上柱樣品。
[0052] Π 、離子交換層析 [0053] (1)配制緩沖液
[0054] 平衡緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0 · 016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0 · 11M;調pH7 · 0;
[0055] 洗滌緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0 · 016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0 · 125M;調pH7 · 0;
[0056] 洗脫緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0 · 016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0 · 3M;調pH7 · 0;
[0057] (2)以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為層析柱填料;將步驟I得到的待上柱樣品上 層析柱，首先使用7-13倍層析柱體積的平衡緩沖液，層析流速為lOOcm/h;然后使用2-4倍層 析柱體積的洗滌緩沖液，層析流速為l〇〇cm/h;最后使用1-3倍層析柱體積的洗脫緩沖液，層 析流速為l〇〇cm/h;收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。
[0058] III、FVIII成品的制備
[0059] (1)超濾：用含枸櫞酸鈉、氯化鈣、鹽酸精氨酸的緩沖液對步驟Π 獲得的洗脫液進 行超濾透析，超濾透析完成后，加入人血白蛋白使其濃度為8g/L;
[0060] (2)再進行除菌、分裝、凍干，凍干結束后，作80°C，72小時的干熱處理，即得。
[00611 得到的FVIII制品的活性收率為67.5%，比活性為40.5IU/mg;復溶后外觀澄清，無 絮狀，可見異物合格，符合藥典規定。
[0062 ]實施例2本發明人凝血因子VIII的制備 [0063]制備方法具體如下：
[0064] I、層析前處理
[0065] 同實施例1。
[0066] Π 、離子交換層析
[0067] (1)配制緩沖液
[0068] 平衡緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0.016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0.06M;調pH6.5;
[0069] 洗滌緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0.016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0.121M;調pH6.5;
[0070] 洗脫緩沖液包括如下配比的組分:0.01M枸櫞酸鈉，0.001M氯化鈣，0.121M甘氨酸， 0.016M鹽酸賴氨酸，氯化鈉0.25M;調pH6.5;
[0071] (2)以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為層析柱填料;將步驟I得到的待上柱樣品上 層析柱，首先使用7-13倍層析柱體積的平衡緩沖液，層析流速為lOOcm/h;然后使用2-4倍層 析柱體積的洗滌緩沖液，層析流速為l〇〇cm/h;最后使用1-3倍層析柱體積的洗脫緩沖液，層 析流速為l〇〇cm/h;收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。
[0072] III、FVIII成品的制備 [0073] 同實施例1。