水稻水通道蛋白OsPIP1；1及其基因的新應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物基因工程領域，具體涉及水稻水通道蛋白〇sPIPl;l@ryza ytiva ￡lasma membrane intrinsic [rotein 1;1)及其編碼基因和在調控水稻和酵母錦 積累方面的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物，也是重金屬鎘(Cd)富集農作物之一。近年來，我國土 壤污染狀況十分嚴重，其中以土壤鎘污染最為突出。土壤中的鎘被農作物吸收，并通過食物 鏈富集于人體的腎臟、肝臟等器官造成毒害，并引起人體內骨質鈣流失，嚴重危害人體健 康。
[0003] 水稻是一種重金屬鎘富集的農作物。2014年4月，國土資源部和環境保護部公布數 據表明，我國土地的重金屬污染十分嚴重，按照點位超標率計算，我國土壤中鎘超標的土地 已達我國國土總面積的7%。按照污染發生的地區來看，重金屬污染則主要分布于我國的華 中華南地區、泛珠三角地區、長三角地區及東北地區，這些地區均為我國水稻的主要產區， 嚴重影響我國的水稻糧食安全。近年來，由媒體報道的稻米鎘超標事件層出不窮，引起了民 眾巨大的恐慌。克隆和分離水稻體內的鎘脅迫應答和解毒基因，具有重要的意義和潛在的 應用價值。〇sPIPl;l是水稻中的水通道蛋白之一。水通道蛋白首次在人類紅細胞中得以鑒 定，主要介導水分子的跨膜轉運，該項發現于2003年獲得了諾貝爾化學獎。植物水通道蛋白 (Aquaporin，AQP)是位于細胞質膜和內膜上的水分子通道蛋白（water channel protein)， 同時也可跨膜運輸甘油、尿素、C02、氨氣、H202等小分子和硅、砷、硼、硒、銻等類金屬。植物水 通道蛋白參與應答包括鹽脅迫、干旱和冷脅迫等多種非生物脅迫，這類脅迫應答主要與維 持細胞內水平衡相關;近期的研究發現，部分植物水通道蛋白成員在類金屬的跨膜轉運和 維持細胞內類金屬內穩態方面發揮重要作用。
[0004] 在本發明中，我們描述了水稻水通道蛋白0sPIPl;l基因的表達能夠影響重金屬鎘 在生物體內的積累，提供了將該基因應用于重要糧食作物一一水稻的低鎘遺傳育種技術， 本發明也可應用于工程菌一一釀酒酵母的低鎘遺傳改造。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個目的是提供一種水稻水通道蛋白OsPIPl; 1及其編碼基因 OsPIPl; 1的新應用。
[0006] 實現上述目的的技術方案如下。
[0007] 氨基酸序列如SEQ ID N0.2的水稻水通道蛋白OsPIPl ;1和/或OsPIPl ;1基因在水 稻中降低重金屬鎘積累的應用，所述OsPIP1; 1基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列，或為與SEQ ID NO. 1互補配對的核苷酸序列，或為編碼序列氨基酸序列如SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。
[0008] 本發明的水稻胰蛋白酶抑制劑OsPIPl ;1，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編 碼基因 OsPIPl;l的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。應當理解，考慮到密碼子的簡并性，在 不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進行修改，也屬于本發明的保 護范圍內。
[0009] 本發明的另一的是提供一種RNAi片段的表達載體，該表達載體克隆有上述針對水 稻水通道蛋白基因 OsP IP 1; 1的RNAi片段。使用該RNAi載體在水稻體內轉基因，可用于培育 水稻低鎘品種。
[0010] 實現該目的的技術方案如下。
[0011]插入有核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的核苷酸片段的RNAi表達載體。
[0012] 優選地，所述表達載體為PTCK303。
[0013] 本發明的另一目的是提供上述RNAi表達載體的制備方法。
[0014] 實現該目的的技術方案如下。
[0015] RNAi表達載體的制備方法，包括有以下步驟：
[0016] (l)將核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的核苷酸片段連接于pGEMT-Vector上形成 pGEMT-PIPRI；
[0017] (2)用SacI和Spel雙酶切pGEM T-PIPRI，回收得到片段F1，同時用SacI和Spel雙酶 切載體PTCK303,將回收后的F1片段與經SacI和Spel雙酶切處理后的pTCK303載體連接，形 成PTCK303-PIPRI-F1;
[0018] (3)用BamHI和ΚρηΙ雙酶切pGEM T-PIPRI并回收得到片段F2,然后將片段F2與 BamHI和ΚρηΙ雙酶切處理后pTCK303-PIPRI-Fl載體連接，即得。
[0019] 優選地，核苷酸序列如SEQ ID Ν0.3所示的核苷酸片段，通過以下方法得到：以水 稻基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5為引物，進行擴增，回收擴增產物。
[0020] 本發明的另一目的是提供上述RNAi表達載體的應用。
[0021] 實現上述目的的技術方案如下。
[0022] 上述RNAi表達載體在水稻中降低重金屬鎘積累的應用。其可用于培育水稻低鎘品 種。
[0023] 本發明的另一目的是提供一種降低水稻中重金屬鎘積累的生物制劑。
[0024] 實現上述目的的技術方案如下。
[0025] -種降低水稻中重金屬鎘積累的生物制劑，其活性成份為上述的RNAi表達載體， 或含有0sPIPl;l基因。
[0026] 上述的0sPIPl;l基因、水稻超表達載體和/或RNAi表達載體，可以制備成生物制 劑，用于降低水稻中重金屬鎘積累，用于水稻的低鎘遺傳育種。
[0027]本發明的另一目的是提供一種降低水稻中重金屬鎘積累的方法。
[0028]實現上述目的的技術方案如下。
[0029] 一種降低水稻中重金屬鎘積累的方法，該方法步驟中包括調控0sPIPl;l基因的表 達，所述0sPIPl;l基因的cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或為與SEQ ID N0.1互 補配對的核苷酸序列，或為編碼序列氨基酸序列如SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0030]本發明的有益效果如下：
[0031 ] 在本發明中，我們通過對篩選文庫獲得的OsPIPl ; l@ryza ptiva Elasma membrane intrinsic protein 1;1)基因的進一步研究，發現該基因具有以下應用：（1)該 基因在釀酒酵母中的超量表達能夠降低酵母細胞對重金屬鎘的積累，促進酵母體內鎘的外 排；（2)通過將OsPIPl; 1基因在水稻中RNAi，降低轉基因水稻株系中OsPIPl; 1基因的表達 量，可以影響轉基因水稻種子中鎘含量，得到低鎘富集的轉基因水稻品系。該基因可應用于 工程菌及水稻針對體內鎘含量改變的遺傳工程育種，也可應用于其他植物的針對體內鎘富 集的遺傳工程育種。
【附圖說明】
[0032] 圖1示構建完成的釀酒酵母重組表達載體OsPIPl; l-pYES2示意圖。
[0033]圖2示轉化OsPIPl; l-pYES2的轉基因酵母在含鎘培養基中生長后鎘積累降低。 [0034] 圖3示構建完成的水稻轉基因 RNA干涉載體OsPIPl; l-pTCK303示意圖。
[0035] 圖4示水稻OsPIPl; 1轉基因 RNAi植株的qRT-PCR檢測。
[0036] 圖5示野生型水稻種子和OsPIPl; 1轉基因 RNAi水稻種子中鎘含量的比較。
【具體實施方式】
[0037] 本發明主要闡述OsPIPl ;1基因在調控鎘積累生物工程方面的應用。本發明以水稻 日本晴品種幼苗葉片為材料提取RNA，并將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，設計引物 PIPF: 5 ' -ATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3 ' 和PIPR: 5 ' -TTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3 '，并采用高保 真的Taq酶擴增OsPIPl; 1基因的cDNA閱讀框全長，回收得到的片段連接于pGEM T-vector， 形成OsPIPl ;l-pGEM T重組質粒，并測序。OsPIPl ;1基因在水稻基因組數據庫(MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource,http:// rice .plantbiology .msu · edu/index · shtml)中的編號為L0C_0s02g44630，命名為OsPIPl; 1 (Qryza ytiva Elasma membrane Intrinsic Er〇tein 1; 1)。該基因編碼一個包含87〇個 豐i苷酸的開放閱讀框，其序列如SEQ ID NO. 1所示。其編碼蛋白具有289個氨基酸殘基，其序 列如SEQ ID N0.2所示。
[0038] 在本發明中，通過構建酵母轉基因超表達載體OsPIPl; l-pYES2,并將該載體轉化 釀酒酵母，通過該基因在酵母體內的誘導表達，可以降低酵母對重金屬鎘的積累。用于構建 酵母表達載體的引物為OsPIPl; 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3 ' 和 OsPIPl; 1YER:5'-TAGATGCATGCTCGAGTTAAGACCTGCTCTTGAATGG_3'。通過該對引物以重組質 粒OsPIPl; 1-pGEM T為模板，采用高保真Taq酶PCR擴增OsPIPl; 1基因的cDNA閱讀框片段，回 收的DNA片段插入酵母表達載體pYES2的BamHI和Xhol酶切位點之間。經測序驗證正確后，即 形成OsPIPl; 1基因在酵母中的轉基因誘導超表達載體OsPIPl; 1-p YES2(如圖1所示）。將該 重組載體OsPIPl; 1-PYES2采用醋酸鋰的方法轉化進入釀酒酵母中，采用誘導的極限培養基 (添加半乳糖)培養酵母轉化子克隆，以轉化PYES2空載體的酵母菌株為對照，30°C培養酵母 至0D600為1.5-2，然后在培養基中添加1(^1和3(^1的0(1(：1 2，重新培養24小時，離心收獲酵 母細胞，用雙蒸水清洗3遍，65°C干燥3-5天，干燥的酵母塊將微波消解后，采用火焰法原子 吸收光譜測定酵母細胞中鎘的積累。
[0039]本發明還描述了將OsPIPl ;1基因用于水稻的低鎘轉基因育種。水稻是一種淹水地 栽培的農作物，對水分的需求極其旺盛，而水通道蛋白主要負責對水的吸收和轉運，因此水 稻體內的水通道基因對水稻的正常生長及其重要。在本發明中，我們首次將水稻的水通道 蛋白基因和水稻對重金屬鎘的積累聯系起來，通過RNAi技術下調OsPIPl;l基因在水稻中的 表達，可以獲得稻米中低富集鎘的水稻轉基因品系。
[0040]本發明中，用于構建水稻轉基因RNA干涉載體為pTCK303,該載體來源于 PCAMBIA1301。以重組質粒OsPIPl; 1-pGEM T為模板進行PCR擴增。設計引物為OsPIPl; 1RIF: S'-GGGGTACCACT