表達量無顯著差異。
[0129] 2、轉基因水稻的紋枯病抗性鑒定
[0130] 以野生型水稻、轉空載體水稻、株系L1、株系L2、株系L3、株系L4、株系L5、株系L6、 株系L7、株系L8和株系L9為實驗材料，測定水稻的紋枯病抗性。
[0131] 實驗重復三次，每個株系每次種植10株，在水稻分蘗末期至拔節初期采用嵌入接 種法接種菌株YN-7。每株水稻接種3個主莖桿，每個主莖桿以鑷子將接種物嵌入自上而下第 3葉鞘內側。
[0132] 實驗材料抽穗后35天記錄實驗材料田間紋枯病發病情況，并按照記載在文獻（左 示敏等，揚州大學學報:農業與生命科學版.2007 (27): 57-61)中的紋枯病病級劃分標準進 行病級調查。結果表明（圖2中C和圖3)，株系L1、株系L2、株系L3、株系L4、株系L5、株系L6、株 系L7、株系L8和株系L9的紋枯病病級均低于野生型水稻的紋枯病病級，野生型水稻和轉空 載體水稻的紋枯病病級無顯著差異。可見，在水稻中過表達OsOSMl基因可提高水稻對紋枯 病的抗性。
[0133] 五、轉基因水稻植株的農藝相關性狀和產量相關性狀的觀察和統計
[0134] 以野生型水稻、株系L1、株系L2、株系L3、株系L4、株系L5、株系L6、株系L7、株系L8 和株系L9為實驗材料，進行農藝相關性狀和產量相關性狀的觀察和統計。
[0135] 實驗重復三次，每個株系每次種植10株，待實驗材料處于成熟期，觀察和統計如下 農藝性狀:生育期、分蘗角、株高、劍葉高、劍葉長、劍葉寬、穗長、粒長、粒寬、每株穗數、每穗 粒數、結實率、千粒重、單株產量。實驗結果見表2、表3和圖4(A為抽穗后30天的株型表型，B 為抽穗后60天的穗部表型，C為抽穗后60天的籽粒表型，其中左圖均為野生型水稻，右圖均 為株系L3)。結果表明，株系L1、株系L2、株系L3、株系L4、株系L5、株系L6、株系L7、株系L8、株 系L9和野生型水稻的農藝相關性狀和產量相關性狀基本沒有差異。
[0136]表2.農藝相關性狀統計結果
[0137]
[0139] 注:HD為抽穗期，ΤΑ為分蘗角，PH為株高，FLL為劍葉長，FLW為劍葉寬。
[0140]小寫英文字母表明5%水平的顯著差異，相同字母表明沒有顯著性差異。 [0141 ]表3.產量相關性狀統計結果
[0142]
[0143] 注:PL為穗長，GL為粒長，GW為粒寬，PNP為每株穗數，SNP為每穗粒數，RFG為結實 率，1000GW為千粒重，PY為單株產量。小寫英文字母表明5 %水平的顯著差異，相同字母表明 沒有顯著性差異。
[0144] 六、OsOSMl基因亞細胞定位
[0145] A、按照下述步驟構建重組載體pGDG/OsOSMl-GFP:
[0146] 1、模板的獲得:采用Trizol法提取水稻品種日本晴幼嫩葉片的總RNA，將該總RNA 用逆轉錄酶反轉錄出第一鏈cDNA。
[0147] 2、合成引物F: 5 ' -CCGCTCGAGATGGCGAACAAGCTGCAGCTC-3 '（下劃線為限制性內切酶 Xhol識別序列）和R: 5 ' -CGGGATCCCTAGTTGTCGGCGACGTCGAC-3 '（下劃線為限制性內切酶 BamHI識別序列）。
[0148] 3、完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟2合成的F和R為引物進行 PCR擴增，得到約719bp的N端含有限制性內切酶Xho I和C端含有限制性內切酶BamHI的雙鏈 DNA分子。
[0149] 4、將步驟3中得到的N端含有限制性內切酶Xho I和C端含有限制性內切酶BamHI的 雙鏈DNA分子連接至載體pGDG，得到重組質粒35S: :GFP-0s0SMl(部分結構示意圖見圖5中 A)〇
[0150] 根據測序結果，對重組質粒35S: :GFP-0s0SMl進行結構描述如下：向載體pGDG的 Xho I和BamM酶切位點之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。
[0151] B、將步驟A構建的重組質粒35S: :GFP-0s0SMl導入根癌農桿菌EHA105,得到重組農 桿菌，命名為EHA105/35S: :GFP-0s0SMl。然后按照文獻(郭麗，鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆 及對煙草的轉化，2006年甘肅農業大學碩士畢業論文）記載的方法將EHA105/35S: :GFP-OsOSMl轉化4周齡的煙草葉片，轉化2~3天后，在共聚焦顯微鏡下觀察煙草表皮細胞的瞬時 表達結果。
[0152] 按照上述方法，將重組質粒35S: :GFP-0s0SMl替換為質粒pGDG，其它步驟均不變， 在共聚焦顯微鏡下觀察煙草表皮細胞的瞬時表達結果，作為對照。
[0153] 實驗結果見圖5中B(左為熒光，中為明場，右為熒光和明場的整合;35S: :GFP為對 照）。結果表明，OsOSMl基因定位在細胞質膜上。
【主權項】
1. 蛋白質OsOSMl在調控植物抗病性中的應用;所述蛋白質OsOSMl為al)或a2)或a3): al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質； a2)在序列表中序列2所示的蛋白質的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質；a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的與抗病性相關的蛋白質。2. 編碼權利要求1所述蛋白質OsOSMl的核酸分子在調控植物抗病性中的應用。3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于:所述編碼權利要求1所述蛋白質OsOSMl的核 酸分子為如下bl)或b2)或b3)所示的DNA分子： bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； b2)與bl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權利要求1所述蛋白 質OsOSMl的DNA分子； b3)在嚴格條件下與(bl)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1所述蛋白質OsOSMl的DNA分子。4. 如權利要求1至3任一所述的應用，其特征在于:所述植物是如下cl)至c5)中的任一 種： cl)雙子葉植物；c2)單子葉植物； c3)禾本科植物； c4)水稻； c5)水稻品種徐稻3號。5. 如權利要求1至4任一所述的應用，其特征在于:所述抗病性為抗紋枯病。6. -種培育抗病性轉基因植物的方法，包括如下步驟：向受體植物中導入權利要求1所 述蛋白質OsOSMl的編碼基因，得到抗病性強于所述受體植物的轉基因植物。7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于:所述權利要求1所述蛋白質OsOSMl的編碼基 因為如下bl)或b2)或b3)所示的DNA分子： bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； b2)與bl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權利要求1所述蛋白 質OsOSMl的DNA分子； b3)在嚴格條件下與(bl)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1所述蛋白質OsOSMl的DNA分子。8. 如權利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述受體植物是如下cl)至c5)中的任一 種： cl)雙子葉植物；c2)單子葉植物； c3)禾本科植物； c4)水稻； c5)水稻品種徐稻3號。9. 如權利要求6至8任一所述的方法，其特征在于:所述抗病性為抗紋枯病。10. 如權利要求1至4任一所述的應用或權利要求6至8任一所述的方法，其特征在于:所 述抗病性為抗立枯絲核菌引起的病害。
【專利摘要】本發明公開了蛋白質OsOSM1在調控植物抗病性中的應用。本發明所提供的蛋白質OsOSM1為a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質；a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與抗病性相關的蛋白質。實驗證明，在水稻中過表達OsOSM1基因可提高水稻對紋枯病的抗性，其紋枯病病級均低于野生型水稻的紋枯病病級，對抗紋枯病新材料的選育具有重要作用。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/29, A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105481958
【申請號】CN201610023763
【發明人】左示敏, 張亞芳, 薛薌, 陳宗祥, 潘學彪
【申請人】揚州大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月14日