基于平行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種化合物的制備方法，尤其涉及基于平行分離模式制備色譜分離棘 豆中新化合物方法。
【背景技術】
[0002] 棘豆屬(Oxytropis D.C.)植物屬于豆科蝶形花亞科。該屬植物為多年生草本，半 灌木或灌木，全世界約為300多種，而我國有棘豆屬植物131種(藥用植物為20余種），分別分 布于甘肅、青海、內蒙古、四川、西藏等地。棘豆屬藥用植物曾被收載于1977年版中國藥典， 其在我國分布廣泛，且民間常用于藏藥和蒙藥的復方之中。
[0003]藏藥棘豆（Oxytropis falcate Bunge)(藏藥名為莪達夏）是豆科（Leguminosae) 棘豆屬(Oxytropis D.C.)多年生草本植物。生長在2700~4300 m的河灘、沙地、山坡、草甸， 產于青藏高原。棘豆主要具有抗炎止疼、清熱解毒、止血等功效，用于利便、除毒、清腫、止 血，可治療麻風病、流感及扁桃體炎等多種病癥。由于其突出的療效，具有"草藥之王"的美 譽。棘豆是藏醫常用的三大抗炎藥之一，藏醫在臨床上使用廣泛，它是六味棘豆散、九味青 鵬散、奇正藏貼、奇正消痛貼膏的多種藏藥復方或藏成藥的主要藥物，是一味非常具有研究 和開發價值的天然藥物。
[0004] 甘肅棘豆(Oxytropis kansuensis Bunge)是棘豆屬有毒植物品種之一，同時具有 較強的藥理活性，尤其在藏藥中使用較多，具有解毒醫瘡，止血利尿，治療各種內出血癥。 [0005] 多葉棘豆(Oxytropis myriophylla (Pall) DC.)在蒙藥中使用較多，主要用于痕 疫、炎癥、丹毒、腮腺炎、麻疹、痛風、各種刺疼和出血等癥。
[0006] 目前，各國學者對棘豆屬20多種藥用植物分離得到了 140多個化合物，其中多以黃 酮類、三萜類和生物堿類化學成分居多，，沒有系統深入地研究棘豆中活性物質的作用機 制，僅對其進行了初步的藥理活性研究。同時，也無法穩定獲得純度為98%以上的化學對照 品，不能滿足棘豆新藥創制及相關制劑的質量控制要求，從而制約了棘豆藥材的藥用開發 研究。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種工藝簡單、重復性高、回收率高的基于平 行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物方法。
[0008] 為解決上述問題，本發明所述的基于平行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物 方法，包括以下步驟： ⑴制備棘豆提取物浸膏： 將棘豆用體積濃度為5~95%的乙醇或體積濃度為5~100%的甲醇進行微波提取，得到提 取液;所述提取液經減壓濃縮后得到棘豆提取物浸膏； ⑵萃取： 將所述棘豆提取物浸膏用其質量卜10倍的去離子水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯 進行萃取，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位； (3)所述水部位注入大孔樹脂層析柱中，依次用5~50倍柱體積且體積濃度為20%、40%、 60%、80%的乙醇進行洗脫，分別得到20%、40%、60%、80%的洗脫部位； ⑷將所述40%的乙醇部位干燥至恒重后，得到40%乙醇部位干燥粉末； (5)將所述40%乙醇部位干燥粉末用其質量的1~30倍的去離子水溶解后，注入到具有平 行分離模式的制備色譜裝置中，經過一級制備色譜柱分離并用20倍柱體積、體積濃度為40% ~60%甲醇沖洗樣品、在線紫外檢測，得到目標化合物組分，該目標化合物組分經捕集設備進 行富集濃縮，然后進入二級制備色譜柱，經二級制備色譜柱分離、體積濃度為40%~60%的甲 醇洗脫、在線紫外檢測，即得符合化學對照品要求且純度>98%的新化合物1^_?€從 〇13-〇-a-L-rhamnopyranosy1-(1^2)-[6-0-(3-hydroxy-3-methylglutaryl)-b~D-glucopyranoside0
[0009] 所述步驟⑴中棘豆為鐮形棘豆、甘肅棘豆、多葉棘豆中一種。
[0010] 所述步驟⑴中微波提取的條件是指料液比為1 g:5 mL~30 mL，提取溫度為60~95 °C，提取次數1~4次，每次1~4 h，微波功率為1~100KW。
[0011]所述步驟⑴中減壓濃縮的條件是指壓力為〇. 02~0.07MPa。
[0012]所述步驟⑷中干燥的條件是指溫度為50~80°C。
[0013]所述步驟(5)中一級制備色譜柱的分離條件是指流速為20~60mL/min，檢測波長為 200~400nm〇
[0014] 所述步驟(5)中一級制備色譜柱中的色譜填料為C18或C8鍵合相填料，填料粒徑為5~ 20um〇
[0015] 所述步驟(5)中捕集設備吸附填料為聚苯乙烯或甲基丙烯酸-二乙烯基苯聚合物。
[0016] 所述步驟(5)中二級制備色譜柱中的色譜填料為Sephadex LH-20。
[0017] 所述步驟(5)中二級制備色譜柱的分離條件是指流動相為體積濃度為40%~60%的甲 醇，流速為〇 · 5~5mL/min，檢測波長為200~400nm〇
[0018] 本發明與現有技術相比具有以下優點： 1、本發明采用具有平行分離模式的制備色譜裝置分離制備新化合物，不但工藝簡單， 實用性高，而且實現了樣品的快速分離制備；同時，在保證高效分離的前提下，提高了樣品 的化學品產量，可以獲得克級純度在98%以上的化學對照品（參見圖1、圖2)。
[0019] 2、采用本發明方法獲得的新化合物具有較好抗炎活性，為以后的藥物研發提供了 理論依據。
[0020] 【抗炎實驗】 ⑴實驗動物：昆明種小鼠，雌性，6~8周齡，體重20~25g，分為5組，每組10只。
[0021 ]⑵受試藥物及實驗材料：二甲苯、新化合物1^611^€61'〇13-0-3-1^-rhamnopyranosyl-(1^2)-[6-0-(3-hydroxy-3-methylglutaryl)-b-D-glucopyranoside0
[0022]⑶實驗方法： 小鼠隨機分組，連續給藥一周，每鼠于右耳廓均勻涂10~15ul二甲苯，左耳作對照。2小 時后脫椎處死，剪下小鼠耳廓，用9_的穿孔器將耳廓圓片取下，稱重。
[0023]⑷結果： 表1新化合物對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的抑制作用
注：*p〈0.05，*p〈0.01，*p〈0.001vsmodel〇
[0024]該新化合物能明顯抑制二甲苯所致的小鼠急性炎癥反應，表現出很好的量效關 系。
[0025]【新化合物應用實驗】 ⑴實驗動物:SD大鼠，雄雌性兼備，6~8周齡，體重120~150kg，分為5組，每組10只。
[0026] ⑵實驗方法及結果： 選用健康SD大鼠50只，雄雌各半，體重150±30g，隨機分為5組，分別為空白對照組、陽 性對照組和新化合物的高中低劑量組，按照表2所列計量與途徑給藥。空白對照組灌胃等容 積的生理鹽水，每日給藥1次，連續給藥7d實驗前于每只大鼠左后足關節處做標記，用外徑 千分尺測定大鼠左后足厚度。末次給藥30min后于大鼠左后足拓皮下注射10%蛋清0.1ml致 炎。在致炎后1、2、3、4小時分別測定大鼠左后足厚度，計算各大鼠致炎前后左右后足厚度變 化，以腫脹度(致炎后足厚度值與致炎前足厚度之差值)判斷藥物的抗炎效果。結果見表2。
[0027] 表 2
3、本發明簡單、快速、重復性高，易于推廣。
【附圖說明】
[0028] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0029]圖1為本發明中新化合物色譜圖。其中液相條件為0~30min，40%甲醇~70%甲醇，流 速為lml/min，檢測波長為360nm。
[0030]圖2為本發明中新化合物的光譜圖。
[0031]圖3為本發明中新化合物的C譜圖。
[0032]圖4為本發明中新化合物的Η譜圖。
[0033]圖5為本發明中新化合物的BC譜圖。
[0034]圖6為本發明中新化合物的QC譜圖。
[0035]圖7為本發明中新化合物的COSY譜圖。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1基于平行分離模式制備色譜分離棘豆中新化合物方法，包括以下步驟： ⑴制備棘豆提取物浸膏： 將鐮形棘豆用體積濃度為5%的乙醇進行微波提取，得到提取液；提取液在壓力為 0.02MPa的條件下經減壓濃縮后得到棘豆提取物浸膏。
[0037] 其中：微波提取的條件是指料液比為1 g:5 mL，提取溫度為60°C，提取次數1次，每 次lh，微波功率為1KW。
[0038] ⑵萃取： 將棘豆提取物浸膏用其質量1倍的去離子水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃 取，分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。
[0039] ⑶水部位注入大孔樹脂層析柱中，依次用5倍柱體積且體積濃度為20%、40%、60%、 80%的乙醇進行洗脫，分別得到20%、40%、60%、80%的洗脫部位。