一種新的二萜生物堿類化合物及其制備方法和醫藥用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物技術領域，具體涉及從益母草的干燥地上部分中分離得到的一種 具有治療黑色素瘤作用的二萜生物堿類化合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 益母草（16011111'118」3。011；[0118!10111：1：)為唇形科植物益母草，藥用部分是干燥或新 鮮地上部分，全國各地均產。益母草是一味古老的中藥材，《神農本草經》、《本草綱目》等古 代醫藥著作均有記載。一年或二年生草本全國大部分地區均有分布，生于山野荒地、田埂、 草地等。在夏季生長茂盛花未全開時采摘，味辛苦、涼，活血、祛淤、調經、消水，治療婦女月 經不調，胎漏難產，胞衣不下，產后血暈，瘀血腹痛，崩中漏下，尿血、瀉血，癰腫瘡瘍。古時常 用于婦科疾病，故名為益母。
[0003] 益母草的化學成分是益母草中發揮藥理作用的主要因素。益母草中主要含有的化 合物有:生物堿類，黃酮類，二萜類，苷類，脂肪酸類，揮發油類，環型多肽等，并含有鋅，銅， 錳，鐵等多種微量元素。
[0004] 現代醫學表明，益母草還有溶栓，抗凝，降脂，降血黏度，降低紅細胞聚集，抑制血 小板聚集，改善微循環，抗氧自由基等諸多作用。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種從益母草的干燥地上部分中分離得到的一種具有治療 黑色素瘤作用的二萜生物堿類化合物及其制備方法。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0007] 具有下沭結構式的化合物（I)，
[0008]
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將益母草的干燥地上部分 粉碎，用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用75%乙醇洗脫8 個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇 洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65 :1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1、 15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010]進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0011] 進一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80%。
[0012] -種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學上可接受的載 體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。
[0015] 本發明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結構式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實驗ECD值比較；
[0020] 圖3為BrdU免疫熒光檢測細胞增殖結果。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0022]實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0023] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0024]制備方法：（a)將益母草的干燥地上部分(8kg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提取(25L X3次），合并提取液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和 水飽和的正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(351g)和正丁醇 萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體 積，再用75 %乙醇洗脫8個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏 (133g);(c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(8個柱體 積）、65:1 (8個柱體積）、30:1 (6個柱體積）、15 :1 (8個柱體積)和1:1 (5個柱體積）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進一步分離，依次用 體積比為25:1(8個柱體積）、15:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純 的化合物（I)(31mg)。
[0025] 結構確證：白色粉末;HR-ESMS顯示[M+Na] +為m/z 376.1526，結合核磁特征可得 分子式為C2iH23N〇4，不飽和度為11。核磁共振氫譜數據δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，600MHz): H-1 (1.96， td，J=13.8,5.2)，H-l(3.15，d，J=13.8)，H-2(1.57，m)，H-2(1.68，m)，H-3(1.18，m)，H-3 (1.42，d，J=13.2)，H-5(3.38，s)，H-6(5.72，d，J = 3.0)，H-14(7.26，s)，H-15(3.45，m)，H-16(1.24，d，J = 6.6)，H-17(1.26，d，J = 6.6)，H-18(0.98，s)，H-19(0.91，s)，H-21(7.98，s); 核磁共振碳譜數據3。(？?111，0130-(1 6，1501他）：26.2(〇12，1-〇，18.2(〇12,2-〇,38.1(〇1 2,3-C)，31.1(C，4-C)，42.8(CH，5-C)，77.1(CH，6-C)，190.7(C，7-C)，131.5(C，8-C)，121.8(C，9-C)，45·7(C，10-C)，145·8(C，n-C)，138.6(C，12-C)，141.7(C，13-C)，122.8(CH，14-C)，29.1 (CH，15-C)，22.3(CH3，16-C)，22.4(CH3，17-C)，31.1(CH3，18-C)，21.7(CH 3，19-C)，177.1(C， 20-C)，151.8(CH，21-C);碳原子標記參見圖U13C NMR譜顯示了21個共振碳信號，包括四個 甲基，三個亞甲基，五個次甲基，以及九個季碳。紅外光譜顯示〇C = N功能團（1527和879(?^) 的吸收帶，表明該化合物含有惡唑環。HMBC譜中，Η-14(δΗ7.26)和Η-15(δΗ3.45)與季碳（δ C138.6)的相關性表明該季碳位于C-12位，則惡唑環的另一個季碳為C-11(SC145.8)<X-11 (δ(：145.8)和C-12(SC138.6)的化學位移表明該惡唑環的N原子與C-12相連，0原子與C-11相 連。!1]\?(：譜中，]\^-210!17.98)與(：-11和(：-12 ;!1-15與(：-12，(：-13(5(：141.7)和(：-14(3 C122.8);H-14 與 〇7(3(：190.7)，(：-9(3(：121.8)和(：-12的相關性驗證了上述推論。1?(^5￥譜 中，Me-18與H-5，H-5與H-6的相關性表明，H-5和H-6為α構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和 R0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構型進一 步通過Ε⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0026]實施例2:化合物(I)藥理作用試驗 [0027] 一、材料和儀器
[0028]人Α375黑色素瘤細胞株由第三軍醫大學贈。化合物（I)自制，制備方法見實施例1， HPLC歸一化純度大于98%<^ΜΕΜ培養基、0.25%胰酶購自美國Gibco公司。ΜΤΤ(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍）、DMS0(二甲基亞砜）、BrdU購自美國 Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠二抗購自美國Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0029]恒溫C02培養箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產品。超凈工作臺（中國 蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司）。電熱恒溫培養箱（中國 上海躍進醫療器械廠）。自動酶標儀（日本Wako公司）。紫外分光光度儀(美國Beckman公司）。 J6-HC高速離心機(美國Beckman公司）。低溫微量離心機(德國Eppendorf公司）。振蕩搖床 (美國Forma公司）。
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細胞培養
[0032] 1.1細胞復蘇
[0033]將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動 使其盡快融化(大約lmin)。然后吸出細胞懸液，加入到已加有2mL培養基的離心管中，輕輕 吹打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養基。用含有10%FBS和1%的青霉G/鏈霉素的 DMEM培養基8mL制成細胞懸液后，接種至10cm培養盤中。然后置于5 %⑶2、37°C恒溫培養箱 中進行培養。
[0034] 1.2細胞傳代
[0035] 顯微鏡下觀察細胞融合度達80%-90%時即可進行傳代。先用2mL PBS洗滌細胞2 次，然后加入0.25%的胰酶lmL。輕輕水平搖動培養盤，使消化液能覆蓋細胞的表面，然后置 于37°C溫箱中消化約lmi