檢測辣椒環斑病毒的rt-pcr引物對及方法

檢測辣椒環斑病毒的rt-pcr引物對及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于作物病毒檢測技術領域，涉及一種辣椒環斑病毒（Chilliringspot virus，ChiRSV)的檢測，具體涉及一種特異性檢測茄科植物葉片組織中是否感染有辣椒環 斑病毒的RT-PCR引物對及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 馬鈴薯Y病毒屬是馬鈴薯Y病毒科最大的一個屬，有近200種明確的或暫定的病毒 種或亞種。辣椒環斑病毒(Chilliringspotvirus，ChiRSV)是于2008年由Ha等在對越南農 作物上對馬鈴薯Y病毒屬病毒進行調查時，在越南辣椒上首次發現的。2009年被ICTV確定為 馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬的確定種，是辣椒上發現的病毒新種。ChiRSV侵染茄科植物 后出現葉片變小，花葉畸形等癥狀，侵染辣椒后引起的癥狀與辣椒脈斑駁病毒（Chi11i veinalmottlevirus，ChiVMV)引起的癥狀相似，引起嚴重的葉片畸形、扭曲，落花、果實畸 形掉落等癥狀。
[0003] 國內外對煙草花葉病毒屬許多成員的不同株系間的分化和遺傳變異做出較深入 的研究，然而辣椒環斑病毒因為是新發現的病毒卻鮮見對其進行研究與分析。2011年龔殿 等首次報道了該病毒在中國的存在，并首次公布了全基因序列。據王健華等調查顯示， ChiRSV在海南特色辣椒黃燈籠辣椒的檢出率高達6 2 %，且該病毒可與辣椒脈斑駁病毒 (Chilliveinalmottlevirus，ChiVMV)、辣椒輕斑駁病毒（Peppermildmottlevirw， PMMoV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)等多種病毒復合侵染，加重辣椒病 情。章紹延等通過提純病毒，免疫新西蘭大白兔制備了該病毒的多克隆抗血清，為辣椒環斑 病毒的檢測提供了免疫學檢測方法。但其只限于實驗理論階段，并沒有產生相應的試劑盒。 黃建華等人建立了檢測辣椒環斑病毒的PCR引物，但其引物并非針對辣椒環斑病毒的CP基 因，而本申請人實驗室目前獲取的辣椒環斑病毒序列通過Blast比對，發現與目前NCBI上所 報道的辣椒環斑病毒序列匹配度僅為93%-91 %，而使用黃等人建立的PCR檢測引物，擴增 出非目的條帶或無法擴增出目的條帶。另外根據馬鈴薯Y病毒屬重組率高的特點，將PCR檢 測引物建立在非CP基因保守區域存在較大檢測錯誤，或誤檢測的可能。因此，需要找到更加 合適的辣椒環斑病毒PCR檢測引物。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是:針對上述現有技術的不足，提供一種檢測辣椒環 斑病毒的RT-PCR引物對，其針對國內發現的辣椒環斑病毒(ChiRSV)，根據Genbank發布的 ChiRSV的CP保守序列，設計一對特異性引物，同時提供利用該引物對對茄科植株進行RT-PCR檢測的方法，以判斷該茄科植株是否感染辣椒環斑病毒，本方法能夠直接、快速、準確地 檢測出茄科植株是否感染了辣椒環斑病毒。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：一種檢測辣椒環斑病毒的 RT-PCR引物對，該引物對序列如下：
[0006]正向引物ChiRSV-F:GCTGATACACAAGCCGTAGA(如SEQIDNo.l所示）；
[0007]反向引物ChiRSV-R:GCAAACCATACCTTGGCATA(如SEQID吣.2所示）。
[0008] 本發明同時提供一種檢測辣椒環斑病毒的RT-PCR方法，該方法是以上述的引物對 對待測樣品進行RT-PCR擴增，再電泳鑒定。所述擴增產物大小為571bp。
[0009]本發明檢測辣椒環斑病毒的過程如下：
[0010]1)取待測樣品，提取其總RNA;
[0011] 2)以步驟1)得到的RNA為模板，通過反轉錄，得到cDNA;
[0012] 3)以步驟2)得到的cDNA為模板，用前述引物對其進行PCR擴增；
[0013]4)對PCR產物進行凝膠電泳，然后根據擴增產物大小判斷病毒感染情況，若擴增產 物大小為571bp，則待測樣品感染了辣椒環斑病毒。
[0014] 上述PCR檢測的反應體系：10xPCRBuffer5yl、dNTPs5yl、PCRTaq2yl、cDNA模 板2.5μ1、正向引物ChiRSV-F2μ1、反向引物ChiRSV-R2μ1、超純水補至50μ1。反應程序:94 °C預變性2min;40個循環參數為，94°C30s，58°C退火30s72°Clmin;最后72°C10min。
[0015]上述待測樣品為茄科植物。
[0016]本發明檢測辣椒環斑病毒的具體過程如下：
[0017] 1.引物設計:根據Genbank發布的辣椒環斑病毒全基因組或部分序列的保守序列， 依據ChiRSV的CP保守序列，設計引物(見下表1)，檢測引物擴增片段大小為571bp。
[0018] 表1PCR檢測辣椒環斑病毒的引物及片段大小
[0019]
[0020] 2.PCR檢測過程：
[0021 ] 1)待測植株葉片RNA的獲得:取田間茄科植株幼嫩葉片，冰上保存并帶回實驗室， 提取總RNA;
[0022] 2)以步驟1)得到的RNA為模板，以OligodTPrimer為引物，通過反轉錄，得到cDNA；
[0023] 3)以步驟2)得到的cDNA為模板，用表1中的引物對其進行PCR擴增；
[0024] 反應體系（按50μ1計）：10xPCRBuffer5yl、dNTPs5yl、PCRTaq2μ1、模板（cDNA) 2.5μ1、正向引物核苷酸序列2μ1，反向引物核苷酸序列2μ1、超純水補至所需體積。
[0025]PCR程序：94°C2min預變性后，40 個循環參數為，94°C30s，58°C退火 30s72°Clmin，最后 72°C10min。
[0026] 4)PCR產物凝膠電泳，凝膠成像系統拍照，根據目的片段大小及陽性對照，判斷病 毒感染情況。
[0027]本發明根據ChiRSV的CP保守序列設計引物，該引物特異性好且具有較高的靈敏 性;利用該此引物采用RT-PCR方法檢測辣椒環斑病毒(ChiRSV)，不僅于檢測時不需加輔助 引物，而且在降低檢測成本、減少工作量的同時，還能快速、準確、靈敏地鑒定茄科植物是否 受該種病毒的侵染而產生了病毒類疾病，能達到指導生產的目的。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明引物對擴增的序列片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0029] 圖中，M:DNAmarker; 1:以水為模板的對照，2:健康的辣椒葉片，3:感染ChiRSV的 辣椒葉片。
[0030] 圖2為不同退火溫度下，本發明引物對擴增序列片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0031] 圖中，M:DNAmarker;泳道 1-6的溫度分別為60、58、56、54、52和50°(3。
[0032]圖3為模板的不同稀釋倍數下，本發明引物對模板稀釋倍數靈敏度的瓊脂糖凝膠 電泳圖。
[0033] 圖中，M:DNAmarker;泳道1-6的cDNA濃度依次為模板初始濃度的10Q、10-^ΙΟ-2、 10-3、1