鑒定北京泛菌的引物對awf-awr的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及生物技術領域中鑒定北京泛菌的引物對AWF-AWR。
【背景技術】
[0002] 我國從上世紀九十年代開始杏鮑菇規模化栽培。泛菌屬包括作為植物促生菌、生 防菌或植物病原菌的幾個種（Pantoea:insightsintoahighlyversatileanddiverse genuswithintheEnterobacteriaceae,FEMSMicrobiologyReviews(2015)39:968-984)。由泛菌引起的杏鮑菇細菌性軟腐病是近幾年在國內外杏鮑菇工廠化生產中發生的嚴 重病害，報道于北京地區的杏鮑燕軟腐病的病原菌被鑒定及定名為北京泛菌（Pantoea beijingensissp.nov.,isolatedfromthefruitingbodyofPleurotuseryngii.Yu Liuetal.AntonievanLeeuwenhoek(2013)104:1039_1047)。杏鮑燕細菌性軟腐病在生產 車間一旦發生，就很難控制，給杏鮑菇工廠化生產造成嚴重的損失。北京泛菌也是北京地區 發生的白靈燕軟腐病的致病細菌（FirstreportofPantoeabeijingensisinduced softrotdiseaseofPleurotusnebrodensisinChina.Xuetal.PlantDisease (2014)98(7): 1000)。北京泛菌快速診斷技術的開發，對杏鮑菇軟腐病和白靈菇軟腐病的有 效防控具有重要意義。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是如何鑒定或輔助鑒定北京泛菌（P an t〇e a beijingensis)〇
[0004]為解決上述技術問題，本發明提供了北京泛菌特異PCR引物對。
[0005]本發明所提供的北京泛菌特異PCR引物對名稱為AWF-AWR，由引物AWF和引物AWR組 成;所述引物AWF為SEQIDNo.l所示的單鏈DNA分子;所述引物AWR為SEQIDNo.2所示的單 鏈DNA分子。
[0006]本發明還提供了包括北京泛菌特異引物對AWF-AWR的鑒定或輔助鑒定北京泛菌的 試劑或試劑盒。
[0007]上述鑒定或輔助鑒定北京泛菌的試劑或試劑盒還包括進行PCR反應所需的除引物 外的其它試劑。
[0008]本發明還提供了北京泛菌特異引物對AWF-AWR的制備方法，鑒定或輔助鑒定北京 泛菌的試劑或試劑盒的制備方法。
[0009]本發明所提供的北京泛菌特異引物對AWF-AWR的制備方法包括將北京泛菌特異引 物對AWF-AWR的所述兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝的步驟。
[0010] 本發明所提供的鑒定或輔助鑒定北京泛菌的試劑或試劑盒的制備方法，包括將北 京泛菌特異引物對AWF-AWR的所述兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝的步驟。
[0011] 本發明還提供了SEQID13所示的0熟分子。
[0012]SEQID如.3所示的0嫩分子為北京泛菌的特異0嫩片段。
[0013] 北京泛菌特異引物對AWF-AWR在鑒定或輔助鑒定北京泛菌中的應用、鑒定或輔助 鑒定北京泛菌的試劑或試劑盒在鑒定或輔助鑒定北京泛菌中的應用和SEQIDNo.3所示的 DNA分子在鑒定或輔助鑒定北京泛菌中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0014]上述應用均不包括疾病的診斷方法和/或治療方法。
[0015]本發明還提供了鑒定或輔助鑒定北京泛菌的方法。
[0016]本發明所提供的鑒定或輔助鑒定北京泛菌的方法，包括以待測生物樣品的基因組 DNA為模板，用北京泛菌特異引物對AWF-AWR進行PCR擴增得到PCR產物，檢測所述PCR產物的 大小，如果所述PCR產物含有700-1000bp的DNA片段(或所述PCR產物為700-1000bp的DNA片 段），所述待測生物樣品為北京泛菌或含有北京泛菌，或者所述待測生物樣品候選為北京泛 菌或候選含有北京泛菌;如果所述PCR產物不含有700-1000bp的DNA片段(或所述PCR產物不 為700-1000bp的DNA片段），所述待測生物樣品不為北京泛菌或不含有北京泛菌，或者所述 待測生物樣品候選不為北京泛菌或候選不含有北京泛菌。
[0017]上述鑒定或輔助鑒定北京泛菌的方法中，所述700-1000bp的DNA片段具體可為 984bp的DNA片段。
[0018] 實驗證明，北京泛菌特異引物對AWF-AWR只在北京泛菌的基因組DNA中擴增出了特 異條帶，在其它菌株中均沒有得到擴增產物，北京泛菌特異引物對AWF-AWR可用于快速鑒定 北京泛菌。本發明為及早地預防和及時地切斷北京泛菌引起的杏鮑菇軟腐病和白靈菇軟腐 病的傳染源及傳播途徑提供了技術支持，可實現對北京泛菌引起的杏鮑菇軟腐病和白靈菇 軟腐病進行早期預防和控制。
【附圖說明】
[0019]圖1為引物對16spl-16sp2對泛菌的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M: lkbplusDNAladder; 1.北京泛菌（Pantoeabeijingensissp.nov.)JZB2120001T; 2.PantoeagaviniaeDSM22758；3.PantoeaeucalyptiDSM23077；4.Pantoeaanthophila DSM23080；5.PantoeaagglomeransDSM30072；6PantoeadispersaDSM30073；7.Pantoea agglomeransJCM1236；8.PantoeaagglomeransJCM20143；9.Pantoeapleuroti sp.nov.JZB2120015T〇
[0020] 圖2為北京泛菌特異引物對AWF-AWR特異性檢測泛菌的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠 電泳圖。其中，M:lkbplusDNAladder;l.北京泛菌（Pantoeabeijingensissp.nov.) JZB2120001T；2.PantoeagaviniaeDSM22758；3.PantoeaeucalyptiDSM23077； 4.PantoeaanthophilaDSM23080；5.PantoeaagglomeransDSM30072；6Pantoea dispersaDSM30073；7.PantoeaagglomeransJCM1236；8.Pantoeaagglomerans JCM20143;9.Pantoeapleurotisp.nov.JZB2120015T〇
【具體實施方式】
[0021] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0022] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0023]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0024] 下述實施例中的北京泛菌（Pantoeabeijingensissp.nov. )JZB2120001T(即LMG 27579了或隊1^ 32406T)(Pantoeabeijingensissp.nov.,isolatedfromthefruiting bodyofPleurotuseryngii.Liuetal.AntonievanLeeuwenhoek(2013)104:1039-1047)公眾可從北京市農林科學院植物保護環境保護研究所或比利時BCCM/LMG菌種保藏中 心或韓國KCTC菌種保藏中心獲得該菌株。
[0025] 下述實施例中的Pantoeapleurotisp.nov.JZB2120015T