一種檢測白介素28b三個snp位點基因型的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于試劑盒領域，特別涉及一種檢測白介素28B三個SNP位點基因型的試劑 盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)的感染已經成為一個世界性的衛生難 題。據流行病學調查，全球HCV的感染人口接近3%，并且以每年300-400萬的病例遞增，是目 前國際上慢性終末期肝病和肝癌的主要病因之一。由于缺乏有效的疫苗，因此及早發現并 給予有效的抗HCV病毒治療，是丙型肝炎患者治療的關鍵。目前丙型肝炎的抗病毒治療的標 準模式為長效干擾素_a(Pegylatedinterferon-α，PEG_IFN_a)和利巴韋林（ribavirin， RBV)的聯合治療。由于1型丙型肝炎患者的持續病毒應答率低，長期服用相關藥物所帶來的 嚴重不良反應，使得丙型肝炎的抗病毒治療成為一大難題。
[0003] 2009-08/2010-01，世界上有4個獨立的研究小組，各自在不同種族的丙型肝炎患 者中進行全基因關聯(Genome-WideAssociationStudy，GWAS)研究，證實IL-28B區域附近 存在與長效干擾素與利巴韋林標準方案療效相關的單核苷酸多態位點(SNP)。
[0004] 美國杜克大學Ge等報道，19號染色體上IL-28B基因上游3kb的一個單核苷酸多態 位點rsl2979860,與1型丙型肝炎治療的持續病毒反應率、標準方案SVR預測的特異性及敏 感性密切相關，可作為預測1型HCV患者標準方案療效的重要獨立指標。研究表明，具有CC基 因型的患者，標準方案治療所帶來的持續病毒反應率比TT型人群要高2倍左右。有研究證 實，rsl2979860位點CC型對標準方案SVR預測的特異性及敏感性分別達到了 78%和65%，其 作為對1型丙型肝炎患者標準治療方案的持續病毒反應率(SVR)所具有獨特的預測作用，CC 型對非CC型的優勢比達到了 5.79。有研究則進一步證實了該位點的多態性對非1型慢性丙 型肝炎患者，特別是對具有早期病毒學反應(rapidvirologicalresponse,RVR)的這部分 患者標準方案的療效具有同樣的預測作用。
[0005] 澳大利亞悉尼大學的Suppiah等、日本名古屋城市大學Tanaka等以及瑞士伯爾尼 大學Rauch等人通過在不同種族的丙型肝炎中所進行全基因關聯研究中，一致證實了另1個 與持續病毒反應率密切相關的單核苷酸多態位點的存在--即位于IL-28B基因上游8kb的 位點rs8099917。研究表明，相對于其他與1型HCV患者抗病毒方案療效相關的因素，如年齡、 病毒載量等，rs8099917基因型對持續病毒反應及無病毒反應(NVR)的預測最為重要。常見 的rs8099917位點TT型基因與SVR密切相關，可達到50%，NVR僅為12%，GG型患者中，SVR接 近于0%，NVR則可高達80%，GT型的SVR及NVR則介于TT型與GG型之間，這充分說明 rs8099917基因型可以作為預測1型HCV患者標準方案抗病毒治療的另一個指標，特別是針 對NVR的預測。有研究進一步證實，rs8099917對其他非1型HCV患者聯合治療方案療效同樣 具有預測作用。其中rs8099917位點TT型患者的SVR要高于非TT型患者（SVR為76%vs 51%)，特別是對于其中的2&型!1(^患者，經單變量分析可知^8099917位點1'1'型可以作為一 個預測持續病毒反應的獨立指標。
[0006] Tanaka等研究中同時還證實了在日本人中還存在第三個與持續病毒反應率密切 相關的單核苷酸多態位點的存在--即位于IL-28B基因下游3kb的位點rsl2980275。在其 報告中，該位點AA型和AG型患者的持續病毒反應率與位點rs8099917十分相似，分別為 63.6%和17.5%。同時，國內學者研究中也顯示^12980275的基因型在3￥1?、附始且中的相關 性分析r均大于0,呈正相關。rsl2980275基因型AA型與AG型，在SVR和NVR患者中差異均有統 計學意義(P<〇.05)。^12980275多態性可有效地預測干擾素抗病毒治療應答效果，具有獨 立預測抗病毒治療的特征。
[0007] 除上述對治療效果的預測作用外，IL28B基因還與HCV感染流行特點、HCV的自發清 除率、標準治療相關的不良反應也存在著一定的關聯。有研究發現，HCV慢性感染患者中，非 1型HCV患者，rsl2979860位點CC型的概率明顯高于1型患者(66.7%vs39.1%)，CC型的非1 型HCV感染率顯著高于其他基因型的患者。還有研究表明，無論是歐洲還是非洲人群中， ^12979860位點0：別的患者發生的病毒自發清除率，要遠遠高于非0(：患者(歐洲人80.3% vs66 · 7 % ;非洲人56 · 2 %vs37 · 0 % )。此外，研究還發現，rs12979860位點TT型患者食欲不 振、乏力等常見不良反應的發生率明顯低于非TT型患者，其嚴重不良反應發生率僅為 3.1 %，而在CT型、CC型患者中則分別達到了 10.1 %、8.9 %。因此，IL-28B基因型不僅與SVR 存在著很大的相關性，而且在一定程度上也與HCV感染的流行病學分布、自發清除及治療中 所帶來的各種不良反應相關。
[0008] 目前已有多個全基因關聯研究證實，IL-28B基因區域附近的SNP位點rs8099917， rsl2979860和rsl2980275基因型與當前標準方案抗病毒療效密切相關。通過該位點基因型 的檢測，可以達到對丙型肝炎標準方案療效的預測，從而對不同基因型的患者采取區別對 待及治療的原則，從而改變當前丙型肝炎治療策略，提高整個丙型肝炎診療水平。因此， 2011 年美國肝臟病研究協會（AmericanAssociationfortheStudyofLiver Diseases，AASLD)和歐洲肝臟病學會（EuropeanAssociationForTheStudyOfThe Liver，EASL)在更新的HCV感染防治指南已將IL-28B基因多態性列為預測慢性HCV感染療效 的重要的因素。
[0009] 目前關于SNP的檢測包括根據DNA列陣的微測序法、動態等位基因特異的雜交、寡 聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統等，但在所有SNP的檢測方法中，對待檢測片 段進行直接擴增、測序是最為準確的方法，也是SNP分析的金標準。而IL-28Brsl2979860， rs8099917和rsl2980275多態性的研究多采用芯片的方法，但該方法準確度不高，并且成本 較高。本實驗室采用采用的基于PCR擴增后進行直接測序分析的檢測方法，具有準確度高， 特異性和重復性好等特點，可直接對IL-28Brsl2979860，rs8099917和rsl2980275進行序 列比對分析，能準確對SNP位點的基因型進行直觀的判斷，是IL-28Brsl2979860、 rs8099917 和rsl2980275SNP分析的金標準。
【發明內容】
[0010]本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測白介素28B三個SNP位點基因型的試 劑盒及其檢測方法，該試劑盒可用于檢測白介素28B三個SNP位點的基因型，特異性好，靈敏 度高。
[0011 ]本發明的一種檢測白介素28B三個SNP位點基因型的試劑盒，所述試劑盒包括PCR擴增反應試劑以及用于擴增樣本DNA中IL28-B三個SNP位點的PCR引物；其中，SNP位點為： rsl2979860、rs8099917 和rsl2980275;相應的PCR引物如下：
[0015]所述PCR擴增反應試劑包括GoTaq?DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反應緩沖液(Go-Taq ColorlessMasterMix)〇
[0016] 本發明的一種檢測白介素28B三個SNP位點基因型的試劑盒的檢測方法，包括如下 步驟：
[0017] ⑴采集待測血液樣本，提取DNA;
[0018] (2)以該DNA為模板，采用用于擴增樣本DNA中IL28-B三個SNP位點的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應產物，進行測序分析，確定rsl2979860、rs8099917和rsl2980275的基 因型。
[0019] 所述步驟(2)中的PCR反應條件為:95°C5min; 95°C30s-62°C每個循環降低0.5°C至 55°C30s-72°C40s，15個循環；95°C30s，55°C30s，72°C40s，25個循環；最后 72°C10min。
[0020] 所述步驟(2)中的PCR反應體系為:PCR擴增反應試劑10yL，ddH20 6yL，上下游引物 各lyL，樣品DNA2yL。
[0021]由于白介素28B(IL-28B)基因區域附近的SNP位點rs8099917，rsl297986(^P rsl2980275基因型與當前標準方案抗病毒療效密切相關。通過該位點基因型的檢測，可以 達到對丙型肝炎標準方案療效的預測，從而對不同基因型的患者采取區別對待及治療的原 貝1J，從而改變當前丙型肝炎治療策略，提高整個丙型肝炎診療水平。
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