一種用于評估何首烏特異質肝毒性的方法
【技術領域】
[0001]本申請涉及一種用于評估何首烏特異質肝毒性的方法
【背景技術】
[0002]何首烏為寥科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的塊根，是一味著名的傳統補益類中藥，廣泛用于補肝腎、烏發、降血脂的中藥制劑、保健食品，大眾日常餐飲、食療保健，以及洗護發用品等。然而，近年來國內外有關何首烏不良反應的報道大量增加，包括服用生何首烏、制何首烏、含何首烏的復方、中成藥或保健食品等。國內外文獻報道有關何首烏肝損害病例約150例。2006年，英國和澳大利亞藥監部門先后發布了何首烏肝損害警告信息；2013年，我國藥監部門也發布了含首烏制劑肝損害警示。正所謂“千年何首烏，今朝肝毒性”，何首烏肝毒性的問題引起國內外的高度關注。何首烏應用廣泛，據統計我國含首烏的中成藥約500種，保健食品約200種。如果何首烏肝毒性的問題解決不好，將嚴重影響何首烏及相關產品的臨床用藥安全，并可能對中藥國際聲譽和產業健康發展帶來巨大的不利影響。因此，亟待闡明何首烏肝毒性的相關科學機制，為臨床合理用藥、趨利避害提供科學依據。
[0003]然而，目前基于普通正常動物對何首烏肝毒性的評價結果與臨床患者的中毒劑量差異顯著。查閱國內多家單位分別獨立進行的何首烏肝毒性研究文獻表明，何首烏在臨床等效劑量做不出對實驗動物的肝臟損害，需要在超大劑量(40-60g生藥/kg)、長期給藥(4-12周)情況下才能引起大鼠肝損害。但實際上，何首烏在臨床應用過程中出現肝中毒的患者，許多并沒有超劑量服用，服用劑量是在藥典規定范圍(生首烏3-6g/日)之內。藥物的肝臟毒副反應可分為固有肝毒性(intrinsic hepatotoxicity)和特異質肝毒性(id1syncratic hepatotoxicity)兩類，其中前者是指藥物肝損害發生與劑量、時間正相關，用藥個體間差異不明顯；而后者是指藥物肝損害發生存在顯著個體差異，僅有部分人群會發生。盡管何首烏致肝損害的準確發病率數據尚不清楚，根據國家不良反應中心的數據，以及302醫院藥物性肝損害臨床數據庫的統計，推測何首烏肝損害的總體發病率較低，因此考慮何首烏肝損害可能類似于特異質肝毒性。有關何首烏特異質肝毒性的評價研究尚未見報道。
[0004]特異質肝毒性的發生往往和劑量、用藥時間無關，難以預測。特異質肝毒性評價模型一直是國內外毒理學研究的熱點和前沿課題。目前，關于特異質肝毒性發生的機制還不完全清楚，許多研究表明，采用聯合內毒素如細菌脂多糖(lipopolysaccharide’LPS)免疫預干預的動物模型與臨床藥物特異質肝毒性較為近似。然而，有關何首烏是否可以利用LPS進行特異質肝毒性評價的方法尚未見報道。
【發明內容】
[0005]本申請的目的是提供一種用于評估何首烏特異質肝毒性的方法。
[0006]具體的，本申請提供一種用于評估何首烏特異質肝毒性的方法，所述方法包括下述步驟:
[0007]a.何首烏溶液的制備
[0008]制備何首烏的干燥提取物，計算收率；
[0009]測試時，按照何首烏的給藥劑量計算所需干燥提取物的量，采用無菌蒸餾水溶解，貯存，優選地在4°C下貯存，備用；
[0010]b.內毒素溶液的制備
[0011]按照內毒素的給藥劑量計算所需內毒素的量，采用無菌蒸餾水溶解，貯存，優選地在4°C下貯存，備用；
[0012]c.動物實驗
[0013]將大鼠隨機分組，實驗前稱重并記錄，通過灌胃給予大鼠所述何首烏溶液，之后，尾靜脈注射內毒素溶液，然后，麻醉大鼠，下腔靜脈取血，離心，采集血漿標本；
[0014]d.檢測指標
[0015]用酶標儀法檢測血漿標本的肝功能指標血清丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉氨酶(AST)；
[0016]e.統計學處理
[0017]采用SPSS軟件對ALT和AST進行統計分析，計量資料采用單因素方差分析，P
<0.05為有統計學意義。
[0018]當然，本領域的技術人員將理解的是，還可以采用其它統計學處理軟件來進行數據分析。
[0019]在一些實施方式中，所述干燥提取物可以通過以下制備:
[0020]稱取何首烏飲片，用溶劑在室溫下冷浸提取，提取液真空濃縮以除去溶劑，真空干燥，得到干燥提取物；
[0021]在一些實施方式中，所述何首烏飲片的直徑可以為約1cm。
[0022]在一些實施方式中，所述溶劑可以為乙醇，優選地，所述溶劑可以是體積百分數為50%的乙醇。
[0023]在一些實施方式中，所述溶劑的以毫升計的體積可以為所述何首烏飲片的以克計的重量的5-15倍。
[0024]在一些實施方式中，冷浸時間可以為12-72小時。
[0025]在一些實施方式中，所述干燥提取物可以通過以下制備:
[0026]稱取何首烏的飲片，加入體積百分數為50%的乙醇冷浸提取，其中乙醇的以毫升計的體積為所述何首烏飲片的以克計的重量的8倍，冷浸提取2次，每次48h，合并提取液，減壓濃縮回收盡乙醇，真空干燥，得到干燥粗提物。
[0027]在一些實施方式中，所述內毒素可以為細菌脂多糖。
[0028]在一些實施方式中，可以使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠。
[0029]在一些實施方式中，在動物實驗中，何首烏給藥劑量可以為0.54g/kg?75.6g/kg優選地，1.08g/kg?50.4g/kg為導致肝毒性范圍。
[0030]其中，在本申請中，何首烏給藥劑量的單位g/kg是指每kg大鼠的體重給予以g計算的何首烏生藥量，比如0.54g/kg是指每kg大鼠的體重給予0.54g何首烏生藥量。其中，何首烏生藥量可以通過以下計算:稱取的何首烏的飲片的重量X收率。
[0031]在一些實施方式中，在動物實驗中，內毒素給藥劑量可以為1.4mg/kg?5.6mg/kg。優選地，內毒素給藥劑量可以為1.4mg/kg?2.8mg/kg。
[0032]在一些實施方式中，在動物實驗中，可以在給予何首烏溶液2?5小時后，向大鼠尾靜脈注射內毒素溶液。優選地，可以在給予何首烏溶液2?4小時后，向大鼠尾靜脈注射內毒素溶液。
[0033]在一些實施方式中，在動物實驗中，可以在注射內毒素溶液7?10小時后，麻醉大鼠；優選地，可以在注射內毒素溶液7?9小時后，麻醉大鼠。
[0034]在一些實施方式中，實驗所用的大鼠可以為Wistar大鼠、SD大鼠或F344大鼠，優選地可以為SD大鼠。
[0035]在一些實施方式中，所述大鼠的體重可以為150g?300g。優選地，所述大鼠的體重可以為200g?250g。
[0036]本申請采用目前較廣泛采用的基于內毒素的特異質肝毒性動物模型，考察何首烏對大鼠肝臟的損傷作用及其量-毒關系，以期為何首烏肝毒性評價模型和科學機制的研究提供參考。
[0037]與現有的何首烏肝毒性評價方法相比，本申請的用于評估何首烏特異質肝毒性的方法具有如下優點:
[0038]1)本申請基于LPS的用于評估何首烏特異質肝毒性的方法可以評價何首烏的特異質肝毒性；
[0039]2)本申請基于LPS的用于評估何首烏特異質肝毒性的方法可在接近臨床劑量、在較短的時間內評價何首烏肝毒性，與何首烏臨床特異質肝毒性現象比較接近；
[0040]3)在本申請的用于評估何首烏特異質肝毒性的方法中，何首烏聯合LPS給藥組與對照組相比，差異顯著(P < 0.05)，與常規的評估何首烏肝毒性的方法相比，操作簡便，用時較短，經濟成本低。
[0041]因此，本申請提供的基于LPS的用于評估何首烏特異質肝毒性的方法可以快速評價何首烏的特異質肝毒性，為何首烏肝毒性評價模型、科學機制的研究以及臨床應用提供參考。
【附圖說明】
[0042]圖1LPS不同給藥起始時間對大鼠ALT、AST活力的影響；
[0043]圖2不同劑量LPS聯合何首烏后對ALT，AST活力測定的影響；
[0044]圖3LPS聯合何首烏給藥對不同品系的大鼠的ALT、AST活力的影響；
[0045]圖4LPS聯合何首烏給藥對不同體重的大鼠的ALT、AST活力的影響；
[0046]圖5在LPS給藥后的不同時間點下麻醉大鼠并進行檢測時，研究這種不同的時間點對大鼠的ALT、AST活力的影響；
[0047]圖6LPS聯合高劑量何首烏對大鼠的ALT、AST活力的影響；
[0048]圖7LPS聯合接近臨床等效劑量的何首烏對大鼠的ALT、AST活力的影響；
[0049]圖8肝組織的光鏡檢查結果。
【具體實施方式】
[0050]下面通過實施例來描述本申請的實施方式，本領域的技術人員應當認識到，這些具體的實施例僅表明為了達到本申請的目的而選擇的實施技術方案，并不是對技術方案的限制。根據本申請的教導，結合現有技術對本申請技