一種高通量檢測活細胞內sumo修飾底物的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白質研究技術領域。更具體地，涉及一種高通量檢測活細胞內SUM0修飾底物的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]小類泛素修飾因子(Small Ubiquitin-like Modifier，SUMO)是一種可以通過異肽鍵修飾其他蛋白質的小分子多肽，SUM0化是蛋白質翻譯后修飾的一種重要方式，是在動物中發現的類似于泛素的蛋白質修飾方式。SUM0分子在進化中高度保守，廣泛存在于原生動物、后生動物、植物和真菌中，現已發現4種哺乳動物的SUM0分子，分別為SUM01、SUM02、SUM03和SUM04，其中，SUM02、SUM03氨基酸序列非常接近，常合寫為SUM02/3，SUM04是新近發現的第四種SUM0分子。
[0003]在SUM0通路酶的作用下，SUM0分子可以被連接在特定蛋白上，通過這種方式，SUM0影響靶蛋白的定位、穩定性、活性等生化特性，從而調控包括轉錄、mRNA代謝、信號傳導、核組裝、DNA損傷修復等重要生物學通路。研究表明，SUM0化還與多種疾病息息相關，例如I型糖尿病、帕金森、老年癡呆、心臟病以及癌癥等。因此，SUM0化一直是近些年翻譯后修飾研究的熱點。研究SUM0和靶蛋白的相互作用對其影響相關通路的探索顯得尤為重要。目前，已知SUM0可以以共價和非共價的方式修飾底物，這兩種作用均是其行使功能的重要方式。針對SUM0的共價修飾，對于SUM0修飾底物的常見檢測方法為酵母雙雜交系統、免疫沉淀與質譜分析，但是這兩種方法均具有明顯的缺陷。酵母雙雜交系統:(1)假陽性發生較為頻繁，90%結果為假陽性；(2)雙雜交系統要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進入細胞核內，因此并不能適用于所有蛋白；(3)雙雜交系統是基于轉錄的篩選系統，不適用于轉錄激活因子相互作用蛋白的篩選。免疫沉淀與質譜分析:(1)免疫沉淀需要富集足夠多的蛋白，因此采用該方法需要大量細胞，需求細胞的數量一般為108左右；(2)免疫沉淀適合研究有穩定相互作用的蛋白復合體，但不能用來檢測蛋白的瞬時相互作用；(3)免疫沉淀與質譜分析背景信號高，靈敏度低。
[0004]因此，雙雜交系統和免疫沉淀與質譜分析這兩種方法都不適用于檢測蛋白的瞬時和微弱的相互作用。而針對SUM0的非共價修飾，目前尚無任何方法可以單獨鑒定出非共價修飾的方式。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是克服現有鑒定SUM0共價修飾底物的靈敏度不足的缺陷，以及彌補鑒定SUM0非共價修飾底物方法的空白，提供一種可同時檢測特定蛋白共價和非共價修飾底物的檢測方法，用于篩選在刺激或非刺激條件下與目的蛋白相互作用的蛋白網絡，篩選在刺激和非刺激下SUM0共價或非共價修飾底物的結合情況，可篩選SUM0弱結合的蛋白底物，信噪比靈敏度高、假陽性低。
[0006]本發明的目的是提供一種高通量檢測活細胞內SUM0修飾底物的方法。
[0007]本發明另一目的是上述高通量檢測活細胞內SUM0修飾底物的方法在檢測活體細胞內SUM0共價和/或非共價修飾底物方面的應用。
[0008]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
[0009]一種高通量檢測活細胞內SUMO修飾底物的方法，該法基于BiFC系統，以克隆的方式，構建SUM0USUM02/3的C端、N端連接YFPn的逆轉錄表達載體(4個文庫)，將待檢測對象的多個基因(21000個人類基因)的cDNA克隆入含有YFPc的逆轉錄表達載體。病毒感染后，將同時穩定表達以下融合蛋白:SUM01 cvn-YFPn和待篩選基因-YFPc、SUM02/3C-YFPn和待篩選基因-YFPc、SUMOlnvn-YFPn 和待篩選基因-YFPc、SUM02/3nvn_YFPn 和待篩選基因-YFPc ；如果SUM0底物和SUM0發生相互作用，通過流失細胞儀在FITC波長下觀察到發熒光的并檢測信號強弱;該法可同時篩選SUM01/2/3發生共價修飾和非共價修飾的蛋白底物，主要用于篩選在刺激和非刺激下SUM0共價或非共價修飾底物的結合情況，可篩選SUM0弱結合的蛋白底物，信噪比靈敏度高、假陽性低。
[0010]其中，將SUM01、SUM02/3的cDNA亞克隆融合到逆轉錄病毒表達載體PB-CMV-CVN/VN-neo中的策略是:
[0011 ]當需要同時檢測與SUM0發生共價和非共價相互作用的蛋白時，則在SUM01、SUM02/3的cDNA序列的N端上連接YFPn，該策略不影響SUMO發生共價和非共價相互作用；
[0012]當需要檢測與SUM0發生非共價相互作用的蛋白時，則在SUM0USUM02/3的cDNA序列的C端上連接YFPn，該策略屏蔽了 SUMO發生共價修飾所必須的GG氨基酸，僅能檢測發生非共價的相互作用。
[0013]上述方法是基于BiFC技術，將待檢測蛋白基因克隆入含YFPc的逆轉錄病毒表達載體pB-CMV-NC/CC-puro中，再通過逆轉錄病毒的包裝，獲得對應的YFPc-X病毒庫；同時將SUM01、SUM02/3的cDNA亞克隆融合到逆轉錄病毒表達載體pB-CMV-CVN/VN-neo中，構建YFPn-SUMO穩定表達細胞系；再將YFPc-X病毒庫感染YFPn-SUMO穩定表達細胞系，通過BiFC篩選得到SUM0共價和非共價修飾的蛋白底物。
[0014]具體地，上述方法包括如下步驟:
[0015]S1.構建YFPc-X病毒庫:將待檢測活細胞的若干個基因克隆入含YFPc的逆轉錄病毒表達載體pB-CMV-NC/CC-puro中，獲得若干個含YFPc的質粒;然后將含YFPc的質粒分為若干個庫，每個庫含等量的不同質粒，再將這若干個質粒庫進行YFPc-X逆轉錄病毒的包裝，獲得對應的若干個病毒庫；
[0016]S2.構建YFPn-SUMO穩定表達細胞系:將SUM0USUM02/3的cDNA亞克隆融合到逆轉錄病毒表達載體pB-CMV-CVN/VN-neo中，獲得SUM0與YFPn的融合蛋白真核表達載體，進一步構建得到帶有YFPn的誘餌蛋白穩定表達細胞系，即YFPn-SUMO穩定表達細胞系；
[0017]S3.構建YFPn-SUMO與YFPc-X共表達的穩定細胞系:將S1所述若干個病毒庫分別感染YFPn-SUMO穩定表達細胞系，感染后篩選出YFPn-SUMO與YFPc-X共表達的細胞群；
[0018]S4.BiFC篩選:對YFPn-SUMO與YFPc-X共表達的細胞群進行非誘導條件下的相互作用篩選或誘導條件下的相互作用篩選，收集BiFC陽性細胞，擴大培養后提取mRNA，進行PCR擴增，然后進行高通量測序并進行生物信息學數據分析，確定不同文庫序列對應的蛋白底物信息，從而篩選SUM0共價和非共價修飾的蛋白底物；
[0019]其中，步驟S2所述將SUM0USUM02/3的cDNA亞克隆融合到逆轉錄病毒表達載體pB-CMV-CVN/VN-neo中的策略是:
[0020]當需要同時檢測與SUMO發生共價和非共價相互作用的蛋白時，則在SUM01、SUM02/3的cDNA序列的N端上連接YFPn，該策略不影響SUMO發生共價和非共價相互作用；
[0021]當需要檢測與SUM0發生非共價相互作用的蛋白時，則在SUM0USUM02/3的cDNA序列的C端上連接YFPn，該策略屏蔽了 SUMO發生共價修飾所必須的GG氨基酸，僅能檢測發生非共價的相互作用。
[0022]步驟S4所述PCR所用引物為SEQID NO: 1 和SEQ ID NO: 2，以及SEQ ID NO: 3和SEQID NO:4所示引物。
[0023]步驟S4所述生物信息學數據分析的方法是:采用單端保留的方法對雙端測序的結果進行數據分析，確定不同文庫序列對應的蛋白底物信息，從而篩選SUM0共價和非共價修飾的蛋白底物。
[0024]更具體地，上述方法，包括如下步驟:
[0025]S1.構建含YFPc的質粒庫:將哺乳動物基因的cDNA克隆入含YFPc的逆轉