一種檢測復方依山紅提取物對HepG 2.2.15細胞的藥效的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及檢測復方依山紅藥效的方法。更具體地說，本發明涉及一種檢測復方 依山紅提取物對IfepG2.2.15細胞的藥效的方法
【背景技術】
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的一種嚴重的世界范 圍內危害人類健康的疾病，在我國感染率高達10%-20%，HBV持續感染會導致肝硬化和原 發性肝細胞肝癌等肝臟疾病，現有的抗病毒藥物如干擾索和拉米夫定的療效仍然不能令 人滿意，因此尋找安全有效的抗HBV藥物已成為當今醫藥學界一項迫切任務。中醫藥治療慢 性乙型肝炎在我國具有悠久的歷史，近幾十年有學者陸續對一些中草藥進行抗HBV篩查，發 現確實存在一些高效、低毒抑制HBV的中草藥。復方依山紅是從壯族民間挖掘出來的治療乙 型肝炎的經驗方，對慢性乙型肝炎具有較好的治療效果。該方由壯藥材滿山紅、毛雞骨草、 田基黃、牛大力等組成，具有祛邪排毒、清利散瘀、疏通道路、扶助正氣的作用（李常偉，李 兵，盧汝梅，龐宇舟.復方依山紅組方藥材的化學成分研究進展[J].廣西中醫藥，2014,（5): 7-8)。但是目前復方依山紅的藥理機制還未清楚，為了更好地促進復方依山紅制劑的研制， 本發檢測評價復方依山紅提取物對IfepG2.2.15細胞的藥效。
【發明內容】
[0003]本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供一種評價復方依山紅藥效的方 法。目前復方依山紅的藥理機制還未清楚，為了更好地促進復方依山紅制劑的研制，本發明 通過測試所述溶液b的吸光值A及所述上清液a的吸光值&，所述溶液d的吸光值如及所述上 清液c的吸光值A3來計算HepG2.2.15細胞的存活率及不同濃度復方依山紅提取物對HepG 2.2. 15細胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率；確定不同濃度復方依山紅提取物對HepG 2.2.15細胞的藥效，能客觀靈敏的反應復方依山紅藥效，且本發明的檢測方法簡單易操作。
[0004] 本發明提供的技術方案為：
[0005] -種檢測復方依山紅提取物對HepG2.2.15細胞的藥效的方法，所述檢測方法包 括以下步驟：
[0006] 1)、配置不同濃度的復方依山紅提取物溶液；
[0007] 2)、將HepG2.2.15細胞接種到RPM1-1640培養基中培養形成細胞懸浮液；
[0008] 3)、依次將步驟1)中所述的不同濃度復方依山紅提取物溶液分別加入到所述細胞 懸浮液中，其中設有不加復方依山紅提取物溶液的細胞懸浮液作為對照；
[0009] 4)、將步驟3)中加入了不同濃度復方依山紅提取物的細胞懸浮液進行離心，分離 上清液a后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩沖溶液后成溶液b，最后測試 所述溶液b的吸光值A及測試所述上清液a的吸光值A1;將步驟3)中不加復方依山紅提取物 的細胞懸浮液進行離心，分離上清液c后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩 沖溶液后成溶液d，測試所述溶液d的吸光值知及測試所述上清液c的吸光值A3;
[0010] 5)、通過測試所述溶液b的吸光值A及所述上清液a的吸光值^，所述溶液d的吸光 值知及所述上清液c的吸光值A3來計算HepG2.2.15細胞的存活率及不同濃度復方依山紅提 取物對HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率;確定不同濃度復方依山紅提取物 對HepG2.2.15細胞的藥效，其中所述HepG2.2.15細胞的存活率=(A/A2)X100 %，不同濃 度復方依山紅提取物對ifepG2.2.15細胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率=^/%)X100%。 [0011]優選的是，所述配置不同濃度的復方依山紅提取物溶液為:取復方依山紅提取物， 溶于無菌去離子水，制成濃度為 0 · 00032mg/L、0 · 0016mg/L、0 · 08mg/L、0 · 04mg/L、0 · 2mg/L、 lmg/L的復方依山紅提取物溶液。
[0012] 優選的是，所述復方依山紅提取物制備方法:復方依山紅由重量份的壯藥材滿山 紅20、毛雞骨草20、牛大力10、田基黃10、黃根5組成，分別取4份所述復方依山紅，每份65g， 將所述4份復方依山紅分別用95wt%乙醇、60wt%乙醇、30wt%乙醇、水作為提取溶劑，每種 溶劑回流提取三次，合并提取液，減壓干燥后分別得四種復方依山紅提取物，不同濃度的醇 萃取復方依山紅提取物，能夠更好的確定復方依山紅提取物對HepG2.2.15細胞作用的有 效部位。
[0013] 優選的是，所述RPM11640培養基含有遺傳霉素濃度為360-400mg/L、胎牛血清的重 量百分比為8-12 %、谷氨酰胺的濃度為l-3mmol/L、青鏈霉的重量百分比為0.5-2 %和 NaHC03的重量百分比為2-8 %，所述RPM11640培養基的PH值為7.4-7.6，適合HepG2.2.15細 胞培養，能快速高效培養出ifepG2.2.15細胞，并且活細胞數大于90%。
[0014] 優選的是，步驟2)中所述形成細胞懸液后計算細胞總數，活細胞數量不少于細胞 總數的90%，所述Η印G2.2.15細胞濃度為0.5X105個/mL-1.5X105個/mL。
[0015] 優選的是，采用自動酶標儀在吸收波長為515nm條件下測試所述溶液b的吸光值A 及所述溶液d的吸光值A2,在吸收波長為450nm條件下測試所述上清液a的吸光值^及所述上 清液c的吸光值A3。
[0016] 本發明至少包括以下有益效果：
[0017] (1)本發明通過測試并計算HepG2.2.15細胞的存活率及不同濃度復方依山紅提 取物對HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率;確定不同濃度復方依山紅提取物 對HepG2.2.15細胞的藥效;能客觀靈敏的反應復方依山紅藥效，且本發明的檢測方法簡單 易操作，有利于檢測的規范化。
[0018] (2)本發明提供了一種檢測復方依山紅提取物對HepG2.2.15細胞的藥效的方法， 通過復方依山紅提取物對HepG2.2.15細胞的藥效，能客觀地確定復方依山紅提取物的質 量及通過不同濃度醇提取的復方依山紅提取物測試其對HepG2.2.15細胞的藥效，能夠更 好的確定復方依山紅提取物對ifepG2.2.15細胞作用的有效部位。
[0019] 本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本 發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【具體實施方式】
[0020] 結合下面實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書 文字能夠據以實施。
[0021] 實施例1
[0022] 一種檢測復方依山紅提取物對HepG2.2.15細胞的藥效的方法，所述檢測方法包 括以下步驟：
[0023] 1)、配置不同濃度的復方依山紅提取物溶液；
[0024] 2)、將HepG2.2.15細胞接種到RPM1-1640培養基中培養形成細胞懸浮液；
[0025] 3)、依次將步驟1)中所述的不同濃度復方依山紅提取物溶液分別加入到所述細胞 懸浮液中，其中設有不加復方依山紅提取物溶液的細胞懸浮液作為對照；
[0026] 4)、將步驟3)中加入了不同濃度復方依山紅提取物的細胞懸浮液進行離心，分離 上清液a后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩沖溶液后成溶液b，最后測試 所述溶液b的吸光值A及測試所述上清液a的吸光值A1;將步驟3)中不加復方依山紅提取物 的細胞懸浮液進行離心，分離上清液c后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩 沖溶液后成溶液d，測試所述溶液d的吸光值知及測試所述上清液c的吸光值A3;
[0027] 5)、通過測試所述溶液b的吸光值A及所述上清液a的吸光值^，所述溶液d的吸光 值知及所述上清液c的吸光值A3來計算HepG2.2.15細胞的存活率及不同濃度復方依山紅提 取物對HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率;確定不同濃度復方依山紅提取物 對HepG2.2.15細胞的藥效，其中所述HepG2.2.15細胞的存活率=(A/A2)X100 %，不同