一種配合高密度矩陣針電極使用的電轉染緩沖液及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種電轉染緩沖液及其制備方法，特別是涉及一種配合高密度矩陣針 電極電轉染的緩沖液及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 電轉染是一種采用機械方法將極性分子通過細胞膜引入宿主細胞的方法，其原理 是通過電場作用于細胞幾微秒到幾毫秒之后，在細胞膜上暫時形成小孔或開口，把大分子 (如DNA等)導入細胞并最終進入胞核的技術。
[0003]電轉染的過程簡述如下:在電擊過程中，細胞膜上出現穿孔，質粒在電泳力的作用 下與細胞膜接觸，并與細胞膜上電穿孔的區域形成一種可轉移的復合物。瞬時電壓使質粒 脫離復合物并擴散至胞質內，同時小部分質粒進入核內與染色體整合，細胞膜上的小孔自 動重新閉合。
[0004]這種方法不僅能夠將DNA、RNA，還能將抗體、酶及其他生物活性分子轉入細菌、酵 母、動物細胞和植物細胞。它是一種高效、簡便的基因轉移系統，具有其它轉移方法無可比 擬的優越性，如操作簡便、快捷，可重復性強，轉染率高，價格便宜，適用譜廣等。尤其對目前 一般認為難轉染的懸浮培養細胞，亦能獲得較高的轉染率。該技術已經成為相當有效的非 病毒基因轉移技術，并在生物學研究和醫療領域廣泛使用。
[0005] 這種基于電脈沖的高效DNA導入可能與電脈沖導致的細胞膜通透性提高和DNA電 泳效果有關，因此轉染相關的參數如電脈沖強度和持續時間、電極類型和插入方式、DNA的 濃度、轉染緩沖液的成分及濃度等都會影響基因電轉染的效果，對這些參數的優化有助于 提尚基因電轉染的效果，減小毒副作用，提尚其在基礎研究和臨床應用中的可彳丁性。
[0006]產生電場可以采用兩個平行板電極，分別固定在容器內的兩個壁上。將準備進行 電轉染的細胞懸液與希望導入到細胞內的分子混合，加入到電轉染容器內，將其置于兩個 電極之間。改裝后的平行板電極形成了流式電轉染電極，采用同軸處理腔的模式，腔體中心 為陽極，墻壁為陰極，但是同軸電極處理腔內場強分布不均勻，不同部位場強相差明顯。也 有采用立體式電極，但是難以使用到體外的細胞電轉染。經過對立體式電極的改造，形成了 矩陣式電極，不僅能夠提供穩定的電場強度，還可以有效的控制電脈沖強度和持續時間。
[0007]細胞受電擊后產生孔洞使細胞質與電轉緩沖液直接接觸，因此細胞對滲透壓和緩 沖液離子組成十分敏感。從滲透壓來說，低滲緩沖液比等滲或高滲緩沖液更利于獲得較高 轉染率。對于不同的細胞系也可將等滲和低滲的緩沖液按不同的比例混合使用，最佳的混 合物是使細胞在達到最大程度腫脹(達到最大細胞直徑）的同時，細胞裂解死亡率又小于 10%〇
[0008]從電轉緩沖液組成來說，常用的可以分成以下3類：第1類為細胞培養液，如 RPMI1640、DMEM、DMEM/F12、Opti-MEM等；第2類為磷酸緩沖液，如K-PBS，HBS，HeBs，PBS等；第 3類為Cytomix緩沖液，Cytomix配方如下：120mmol/LKCl，0.15mmol/LCaCl2，l〇mmol/LK2 HP〇4(pH= 7.6)，25mmol/LHEPES(pH= 7.6)，2mmol/LEGTA(pH= 7.6)，5mmol/LMgCl2， 2mmol/LATP，5mmol/L谷胱苷肽。相比之下，Cytomix的轉染率最高，特別是對難以轉染的半 貼壁細胞和懸浮細胞，而且死亡率較低。Cytomix緩沖液組成與細胞內離子成份非常相似， 有助于細胞保持其通透性，與常用的電轉緩沖液和完全培養液相比，Cytomix緩沖液中 Ca2+、Mg2+、Na+濃度低，用EGTA代替EDTA，pH值、K+濃度高，該緩沖液最大程度上模擬了真核細 胞內離子環境。
[0009] CN2015106385182對Cytomix緩沖液進行了改良，在Cytomix緩沖液中加入無血清 Opti-MEM培養基、RPMI-1640培養基及roS緩沖液能對細胞起營養保護作用，能增加細胞存 活率。同時加入的ATP和谷氨酰胺可阻止細胞質成分滲漏，加強細胞膜抗氧化作用，有利于 電轉染的重新閉合。能夠明顯提高外源基因在目標細胞的基因電轉染效果并能提高細胞存 活率，通過這種作用一方面可以直接提高基因的電轉染輸送效果，另一方面可以減少外源 基因的使用量或使用相對較低的電壓達到同樣的基因輸送效果。
[0010]CN2014101667597公開了一種優化的電轉染技術轉染懸浮細胞的方法，以預熱的 含10%血清的RPMI-1640細胞培養基為電轉染緩沖液，以合適的濃度混合細胞與外源DNA， 不需要其他的轉染試劑，特別適用于CEMxl74細胞系。
[0011] CN201510280081X公開了一種小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，采用等 滲透壓的緩沖液，緩沖液的組成為KC1 25mM、KH2P〇4〇. 3mM、K2HP〇4〇. 85mM、肌醇280m0smol/kg，PH7.1-7.3，電導率，25度3.2-3.8mS/cm;應用該緩沖液將質粒pmaxGFP(綠色熒光蛋白） 轉染到小鼠成纖維細胞NIH/3T3，轉染效率最高可以達到55 %左右。
[0012] CN201310086625X公開了一種采用正向高壓脈沖和負向高壓脈沖交替使用的方法 進行電轉染，緩沖液的組分為:PBS緩沖液，濃度30-200mM;Tris-HCl，濃度30-150mM;硝酸 鈣，濃度為〇. 2-lmM;氯化鉀，濃度2-8mM;氯化鎂，濃度10-20mM;氯化鈉濃度50-150;葡萄糖， 濃度5-30mM;pH6.5-7.2。在外周血單核細胞轉染綠色熒光蛋白細胞轉染效率達到了 50 %左 右。
[0013]也有人提出電轉染緩沖液的配方為200虛/1葡萄糖、5mM硫酸鎂、2mM/L疏基乙醇、 20mM/LTris-HCI，pH值7.3，但是電轉染時細胞容易成團、死亡率高，轉染效率較低。
[0014]雖然已有各種電轉染緩沖液，但是由于這些緩沖液也存在各種缺陷，例如組分復 雜，對電壓脈沖要求高，電轉染率不高等。而且目前市場上現有的電轉染緩沖液均由各電轉 染儀廠商提供，其組成及物理化學性能未知。并且這些緩沖液均只能與同一廠商的一個或 幾個型號的電轉染儀配合使用。例如Bio-Rad的電轉儀做細胞轉染，必須使用Bio-Rad公司 的GenePulserElectroporationBuffer(貨號：165-2677)緩沖液。
[0015] 在嘗試使用已有的緩沖液與我們自行研發的高密度矩陣針電極進行電轉染時，也 會出現細胞死亡率高，或很低的細胞轉染效率，或者兩種情況同時出現的現象。究其原因主 要是因為高密度矩陣針電極對緩沖液的pH值、滲透壓和電導率的要求比較高。
【發明內容】
[0016] 本發明所要解決的技術問題是提供一種電轉緩沖液，使該緩沖液能夠與高密度矩 陣針電極配合使用，為高密度矩陣針電極電轉染儀提供一種能夠同時實現高細胞存活率和 高轉染率的緩沖液，同時適合絕大多數真核細胞及部分原核細胞。
[0017]電轉染緩沖液的主要組分的濃度分別設置為：氯化鉀10-20mMol/l、葡萄糖10-20mMol/L、三磷酸腺苷5-6mMol/l、蔗糖350-450mMol/l、優選的氯化鉀15mMol/L、葡萄糖 15mMol/L、三磷酸腺苷5 · 2mMol