毛竹轉錄因子nac基因cds序列的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列的應用。
【背景技術】
[0002] NAC(NAM/ATAF/CUC)轉錄因子家族是植物特有的一類轉錄因子，多數NAC蛋白的N 端具有高度保守的NAC結構域，而在C端則具有多元化的激活域。NAC轉錄因子廣泛參與調控 許多生物學過程，如細胞分裂、細胞次生壁合成、器官邊界、開花和衰老等植物生長發育過 程，以及參與調控植物對高鹽、干旱、低溫等非生物逆境脅迫響應過程。在擬南芥中過量表 達八財0)19、4財(：055、1?)26/^麻0)72和414?1/^麻(：002均能提高其抗旱能力 ；過量表達 ATAF2/ANAC081的植物更容易感染枯萎病菌;過量表達JUB1/ANAC042和VNI2/ANAC083能夠 延遲植物衰老，提高對非生物脅迫的耐受能力。在水稻中過量表達0sNAC5、0sNAC9和 OsNACIO能夠顯著擴大根系的分布范圍，從而提高抗旱能力實現高產;過量表達0sNAC5提高 其抗旱、耐鹽的能力；SNAC1轉入水稻和小麥，能夠提高轉基因植株抵抗多種非生物脅迫的 能力。
[0003]竹子是僅次于木材的第二大森林資源，竹產業是我國林業四大朝陽產業之一，竹 子已經被廣泛應用于建筑、家具、造紙、裝飾材料、食品保健、園林景觀、生態修復等領域，是 最具潛力的綠色資源之一。竹子以其生長速度快，繁殖能力強，一次造林，永續利用，適宜山 地造林的特點，在我國造林宜林地日趨減少的情況下，竹林優勢更為明顯。尤其是目前我國 天然林商業采伐全面禁止的情況下，竹資源的開發利用在保障我國木材安全、生態安全以 及貧困山區農民脫貧致富和新農村建設中具有不可替代的作用。毛竹（Phyllostachys edulis)是我國最為重要的筍、材兩用經濟竹種，現有面積443萬公頃，2014年年產毛竹 13.08億根，為彌補我國木材缺口做出了積極貢獻。以毛竹為材料進行NAC轉錄因子研究，對 于更好地開發利用毛竹基因資源，開展抗逆分子育種具有重要的現實意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列的應用。
[0005]為了實現本發明目的，本發明提供毛竹轉錄因子NAC基因CDS序列在促進植物側根 生長發育中的應用。
[0006]本發明所述的毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列為：
[0007] i)SEQIDN0:1所示的核苷酸序列；或
[0008]ii)SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且 表達相同功能蛋白質的核昔酸序列;或
[0009] iii)在嚴格條件下與SEQIDNO: 1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質的核苷酸 序列，所述嚴格條件為在含〇. 1 %SDS的0.1XSSPE或含0.1 %SDS的0.1XSSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0010] iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達相同功能蛋白質的 核苷酸序列。
[0011] 前述的應用，其是將毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列構建到植物雙元表達載體上， 轉化植物，從而促進轉基因植株側根生長發育。
[0012] 本發明述及的植物雙元表達載體包括PCAMBIA1301、改造的pCAMBIA1301等;其中， 所述改造的PCAMBIA1301是在載體pCAMBIA1301的多克隆位點引入花椰菜花葉病毒35S啟動 子和胭脂堿合酶終止子。
[0013] 攜帶有目的片段的表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微 注射、電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998，MethodforPlant MolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463頁；Geiserson和Corey， 1998,PlantMolecularBiology,2ndEdition)〇
[0014] 本發明還提供毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列在提高植物對非生物逆境脅迫的耐 受能力中的應用，所述非生物逆境脅迫包括高鹽、干旱等。
[0015] 前述的應用，其是將毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列構建到植物雙元表達載體上， 轉化植物，從而提高轉基因植株對非生物逆境脅迫的耐受能力。
[0016] 本發明所述的植物包括但不限于擬南芥。將毛竹轉錄因子NAC基因CDS序列構建到 改造的載體PCAMBIA1301上，轉化野生型擬南芥，從而提高轉基因擬南芥植株的耐鹽、抗旱 能力。
[0017] 本發明優選采用農桿菌轉化法轉化植物。
[0018]本發明進一步提供毛竹轉錄因子NAC基因⑶S序列在植物抗性育種中的應用，所述 植物包括但不限于禾本科植物，例如竹子等。
[0019] 本發明首次發現毛竹NAC轉錄因子在植物對抗非生物逆境脅迫中的功能，將毛竹 轉錄因子NAC基因CDS序列導入植物(例如擬南芥）中，得到側根明顯增多的轉基因植株，且 轉基因植株的耐鹽、抗旱能力均明顯提高，為植物的抗性育種奠定了基礎。毛竹NAC轉錄因 子基因在竹子等禾本科植物抗性育種中具有廣泛的應用前景，為植物速生育種提供了新的 基因資源。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明實施例1中基因PeSNAC擴增產物電泳圖；其中，M:DNA分子量標記；1: 擴增產物。
[0021] 圖2為本發明實施例1中毛竹NAC轉錄因子基因結構示意圖。
[0022] 圖3為本發明實施例1中多物種NAC氨基酸序列比較分析;其中，A、B、C、D和Ε為Ν端 NAC保守域中的5個亞結構域。
[0023]圖4為本發明實施例2中正義植物表達載體PeSNACsense的質粒載體圖和酶切檢測 電泳圖；其中，(A):載體圖；（B):酶切檢測電泳圖，M:DNA分子量標記;1:酶切產物。
[0024]圖5為本發明實施例2中反義植物表達載體PeSNACantisense的質粒載體圖；其中， (A):載體圖；（B):酶切檢測電泳圖，M:DNA分子量標記;1:酶切產物。
[0025] 圖6為本發明實施例3中PeSNACsense單克隆菌落PCR電泳結果;其中，M:DNA分子量 標記；1-6 :轉化PeSNACsense的單克隆菌落；7 :PeSNACsense重組表達載體質粒；8: PCAMBIA1301載體質粒。
[0026] 圖7為本發明實施例3中PeSNACantisense單克隆菌落PCR電泳結果;其中，M:DNA分 子量標記；1_6:轉化PeSNACantisense的單克隆菌落;7:PeSNACantisense重組表達載體質 粒;8:pCAMBIA1301載體質粒。
[0027]圖8為本發明實施例4中轉基因擬南芥植株RT-PCR檢測結果；其中，（A):正義PeSNAC基因表達檢測，3-1、3-6、3-8、3-9為不同轉基因植株，11'為野生型植株；（8):反義 PeSNAC基因表達檢測，六-1^-2^-8^-9為不同轉基因植株，11'為野生型植株。
[0028]圖9為本發明實施例5中轉基因擬南芥表型；其中，1:正義PeSNAC基因表達轉基因 植株;2:野生型植株;3:反義PeSNAC基因表達轉基因植株。
[0029] 圖10為本發明實施例6中轉基因擬南芥根系表型及側根數量統計;其中，WT:野生 型植株;S-1:正義PeSNAC基因表達轉基因植株;A-2:反義PeSNAC基因表達轉基因植株。
[0030] 圖11為本發明實施例7中NaCl脅迫條件下轉基因擬南芥表型、存活率統計、Fv/Fm的 變化趨勢;其中，WT:野生型植株;S-1:正義PeSNAC基因表達轉基因植株;A-2:反義PeSNAC基 因表達轉基因植株；（A) :NaCl處理7d后的表型；（B) :NaCl處理10d后存活率統計；（C):NaCl 處理過程中Fv/Fm的變化趨勢。
[0031] 圖12為本發明實施例8中干旱脅迫條件下轉基因擬南芥表型、存活率統計、Fv/^的 變化趨勢;其中，WT:野生型植株;s-1:正義PeSNAC基因表達轉基因植株;A-2:反義PeSNAC基 因表達轉基因植株；（A):干旱處理14d后的表型；（B):干旱處理20d后存活率統計；（C):干旱 處理過程中Fv/Fm的變化趨勢。
【具體實施方式】
[0032]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&RussellDW, Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0033]實施例1毛竹NAC轉錄因子基因⑶S序列的獲得
[0034] 以毛竹(Phyllostachysedulis)葉片為材料，提取葉片總RNA，并反轉錄成cDNA作 為模板，從毛竹基因組數據庫中搜索，分析找到基因組中預測為編碼轉錄因子NAC的DNA序 列，根據該序列的編碼區設計如下引物：
[0035]上游引物：5' -ATGGTGGAGGCGAGGCTGC-3'
[0036]下游引物：5' -TCAATCGAGTGAGTTCCACATCTGTGA-3'
[0037] 對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1 )，切下目的條帶純化回收，將回收 的DNA片段連接到pGEM-Teasy載體上，轉化大腸桿菌(Esherichiacoli)DH5a感受態細胞， 經藍白斑篩選，提取陽性克隆質粒并酶切圖譜分析后，再將單克隆測序，插入片段為867bp， 如SEQIDNo: 1所示。應用Blast在線軟件，將測序的片段與已報道的基因序列進行同源性 比較，發現該插入片段與預測的NAC基因編碼區完全一致，同時與基因組序列比對分析發 現，該編碼區對應的基因組序列含有2個內含子和3個外顯子（圖2)。將該基因命名為PeSNAC (即，毛竹NAC轉錄因子基因⑶S序列）。
[0038]通過Blast軟件在線比較分析，發現該基因編碼的氨基酸序列（SEQIDN〇:2)與其 它單子葉植物的NAC均具有較高的一致性，尤其與同是來自禾本科的水稻(Oryzasativa IndicaGroup)、二糖短柄草（Brachypodiumdistachyon)、谷子（Setariaitalica)、大麥 (Hordeumvulgaresubsp·vulgare)、小麥（Triticumaestium)、節節麥（Aegilops tauschii)和玉米（Zeamays)同源蛋白的一致性都在80 %以上，其中與水稻的NAC (EAZ02065)的一致性最高，達87.0%，N端NAC保守域包含A、B、C、D和E5個亞結構域（圖3)。 由此可見，克隆出的PeSNAC基因為毛竹中的一個全新的NAC轉錄因子基因。
[0039]實施例2攜帶毛竹PeSNAC基因的植物表達載體構建
[0040]以毛竹cDNA為模板，根據SEQIDNo: 1設計引物，植物表達引物兩端分別引入位點Clal和BamHI酶切位點，進行PCR擴增。引物序列如