豬特異性友好位點Pifs302及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及豬特異性友好位點Pifs302。
【背景技術】
[0002] 在轉基因動物的生產過程中，外源基因能否實現在轉基因動物中高效穩定的表 達，是轉基因技術的關鍵。外源基因在受體動物基因組中隨機整合，會由于位置效應表達量 不穩定，受到表觀修飾發生轉基因的沉默。為了實現外源基因的持續穩定表達，定點轉基因 能夠解決位置效應帶來的各種問題。近年來出現ZFN和TALEN技術，以及新出現的CRISPR/ Cas9技術，為基因的定點整合和基因敲除提供了新的工具，提高了轉基因的效率，并在多個 物種中都已經獲得了成功。但是，定點轉基因的關鍵之一在于一個好的整合位點的選擇，一 個好的位點能夠使不同類型的外源基因表達盒穩定一致的表達，對動物細胞或者動物個體 沒有不利影響。目前在大動物中關于安全位點的研究比較少。因此在豬中找到這種適合外 源基因整合的位點是非常重要的。
[0003] 基因組中的安全位點是染色體中的一個位點，整合在這個位點的轉基因能夠在多 個組織中穩定可靠的表達，而且能夠適應不同類型的轉基因表達盒的表達，對內源的基因 結構和表達沒有不利的影響。但是，外源DNA與寄主基因組序列之間的相互作用，會影響轉 基因整合的可靠性和安全性。雖然目的基因的轉導已經取得了巨大的進步，但是基因插入 到受體基因組中什么樣的位點才能使安全性和效率最高卻很少被研究。
[0004] CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas (CRISPR-associated)系統是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質的免疫系統，通過 序列特異的RNA介導，切割降解外源性DNA，包括噬菌體和外源質粒。CRISPR/Cas系統可以作 為一種具有位點特異性的基因編輯系統，其最大的特點是操作簡單、成本低、作用高效。 2013年，科學家首次報道CRISPR/Cas系統在細胞上應用成功，隨后，在斑馬魚、果蠅、小鼠、 大鼠、豬中迅速得到應用。CRISPR/Cas系統在靶位點產生雙鏈DNA斷裂（doublestrand break，DSB)，細胞可通過非同源末端連接(non-homologousendjoining，NHEJ)進行修復， 導致基因發生移碼突變，喪失功能。除此之外，該系統還能與同源重組載體、寡聚核苷酸共 同作用，使靶基因發生高效的精確修飾。2014年，ScottJG等利用CRISPR/Cas介導的同源重 組在斑馬魚上實現了基因的替換。HuiYang等利用相同的策略一步獲得了帶有報告基因的 小鼠。CRISPR/Cas系統憑借其巨大優勢迅速成為基因編輯工具中的佼佼者，在基因功能研 究、疾病模型、基因治療等領域得到廣泛的應用。
[0005] CRISPR/Cas9介導同源重組已在斑馬魚、原蟲、小鼠、大鼠上實現基因的精確編輯， 但在家畜大動物上尚未見報道。
【發明內容】
[0006] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種豬特異性友好位點 Pifs302及其應用。
[0007]為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0008] 第一方面，本發明提供了一個豬特異性友好位點Pifs302,所述友好位點Pifs302 在基因組上的位置為:第15號染色體上第137957233bp(NC_010457.4,基于豬基因組序列信 息版本號Sscrofal0.2,2011 年9月）。
[0009]所述友好位點可用于外源基因的穩定表達，解決轉基因過程中外源基因表達的不 穩定以及位置效應的不可預知性等問題。
[0010]第二方面，本發明提供了特異性靶向所述友好位點Pifs302的sgRNA。
[0011]以及轉錄所述sgRNA的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。
[0012]第三方面，本發明提供了針對所述友好位點PifS302的CRISPR/Cas9打靶載體，所 述打靶載體發揮切割載體功能。
[0013] 進一步地，所述打靶載體的構建方法包括如下步驟：
[0014] 1)將前述DNA序列進行互補配對，形成雙鏈DNA;
[0015] 可選的，將所述DNA序列與SEQIDNo.2所示的核苷酸序列進行互補配對，形成雙 鏈DNA;
[0016] 2)將PX330骨架載體用限制性內切酶Bbsl進行酶切過夜，回收后，與步驟1)得到的 雙鏈DNA連接，即得。
[0017]其中，所述PX330骨架載體為本領域常規載體，可購自Addgene公司。
[0018]作為優選，本發明提供一個最佳的互補配對反應程序，具體為:94°C變性5min，35°C退火lOmin，0~4°C保存。可選的，可將反應物放置在冰上進行保存。
[0019]第四方面，本發明提供了針對前述友好位點的同源重組載體，所述載體含有兩端 帶有Pifs302位點同源左臂和同源右臂的外源目的基因。
[0020] 進一步地，所述同源重組載體的構建方法，包括如下步驟：
[0021] 1)以豬細胞基因組DNA為模板，利用SEQIDNo. 3和SEQIDNo.4所示引物序列擴 增Pifs302位點的同源右臂，利用SEQIDNo.5和SEQID如.6所示引物序列擴增？丨€8302位 點的同源左臂；
[0022] 2)將外源目的基因通過NheI和NotI限制性內切酶連入同源重組載體。
[0023] 更進一步地，所述外源目的基因的兩端帶有ΙοχΡ序列，一端為突變型ΙοχΡ，序列如SEQID吣.7所示，另一端為野生型1(^卩。
[0024]在本發明的一個【具體實施方式】中，為了驗證所述前述位點的友好性，所述外源基 因為來自pEGFP-ΝΙ載體的表達單元EGFP(報告基因）。
[0025]第五方面，本發明提供了一種轉基因方法，將前述打靶載體與前述同源重組載體 按物質的量1:1的比例混合，用電擊轉染或脂質體轉染的方法共轉入豬成纖維細胞。
[0026]本發明的有益效果在于：
[0027]本發明提供了豬特異性友好位點Pifs302,所述友好位點可用于外源基因的穩定 表達，不會因為受到表觀遺傳的修飾發生外源基因的沉默，解決轉基因過程中外源基因表 達的不穩定以及位置效應的不可預知性等問題。本發明提供的豬特異性友好位點Pifs302， 使得對大家畜進行定點整合外源基因變得可靠，為大家畜的定點整合奠定了基礎。本發明 針對豬特異性友好位點Pifs302提供的打靶載體可以高效特異的實現打靶。
【附圖說明】
[0028]圖1是本發明實施例5中所述同源重組載體的結構示意圖。
[0029]圖2是本發明實施例6中PCR法鑒定細胞單克隆，發生定點整合的會擴增出7kb的條 帶，沒有定點整合的只有3kb的條帶。
[0030]圖3是本發明實施例6中在友好位點處的外源基因表達。
【具體實施方式】
[0031]下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
[0032]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0033]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0034] 其中：px330載體購于Addgene公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶購于大連TaKaRa 公司；引物合成及序列測定由上海生工和深圳華大完成;LongAmp Taq DNA聚合酶、QOTNA聚 合酶；Trizol Reagent購于康為世紀公司；反轉錄酶購于Promega公司；SYBR Green購于 Roche公司；質粒去內毒素大提試劑盒、基因組提取試劑盒購于QIAGEN公司；酶切、連接、回 收、轉化、PCR擴增等常規實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
[0035] 實施例1
[0036]實施例1用于說明本發明所述豬特異性友好位點。
[0037] 所述友好位點Pifs302在基因組上的位置為:第15號染色體上第137957233bp(NC_ 010457.4，基于豬基因組序列信息版本號38(^(^310.2,2011年9月）。
[0038]實施例2
[0039]實施例2用于說明特異性靶向本發明所述友好位點Pifs302的sgRNA，該sgRNA由SEQID No.l所示的DNA序列轉錄得到。
[0040] 實施例3
[00411實施例3用于說明針對本發明所述友好位點Pifs302的CRISPR-Cas9打靶載體。[0042] CRISPR_Cas9打靶載體的構建方法如下：
[0043] 1、構建打靶載體
[0044] 將SEQIDNo