hTERT基因反義寡核苷酸、藥物組合物及應用
【技術領域】
[0001]本發明提供了一種hTERT基因反義寡核苷酸、藥物組合物及應用，特別是涉及一種hTERT基因全硫代修飾的反義寡核苷酸、包含有藏藥鐮狀棘豆總黃體酮(TF0F)的藥物組合 物，以及它們在用于制備治療氟它胺耐受型前列腺癌藥物中的應用，屬于基因藥物技術領 域。
【背景技術】
[0002]前列腺癌是男性泌尿系最常發生的腫瘤之一，在美國其發病率在腫瘤患者中占第 一位，死亡率占第二位。研究表明，前列腺癌細胞屬于雄激素依賴性細胞，通過抑制人體雄 激素的產生，前列腺癌細胞生長速度變緩，出現惰性生長的現象，甚至出現前列腺癌轉移灶 萎縮的情況，治療效果良好。隨著抗雄藥物的治療，前列腺癌細胞會由雄激素依賴性轉化為 雄激素非依賴型，抗雄藥物治療會逐漸失去作用。雄激素非依賴型前列腺癌的治療是臨床 上最棘手的問題之一。最新研究表明，雄激素可以調節前列腺癌細胞的端粒酶活性。現已證 明hTERT基因mRNA與端粒酶活性表達一致，其上游表達對端粒酶活性表達起重要作用，被認 為是端粒酶活性表達的限速因子。雄激素阻斷會導致前列腺癌細胞端粒酶限速因子hTERT 基因的表達活性受到抑制伴有癌細胞端粒酶活性的降低，因此使用端粒酶抑制劑替代雄激 素可以降低雄激素非依賴型前列腺癌端粒酶的活性。人類端粒酶主要在雄激素非依賴型前 列腺癌中表達，而在正常組織及良性腫瘤中不表達，表明端粒酶激活與該疾病發生過程關 系密切。
[0003] 鐮狀棘豆為豆科棘豆屬(oxytropisD.C.)植物鐮狀棘豆(O.falcataBunge)的干 燥全草，是一味重要的藏藥。鐮狀棘豆味辛、性寒，有小毒，具有清熱解毒，生肌愈瘡，抗炎鎮 痛，澀脈止血等功效。在藏藥中有"草藥之王"的美譽。鐮狀棘豆主要含有黃酮，生物堿，皂苷 類等成分，藥理研究表明，具有鎮痛，抗炎，抗氧化，抗腫瘤等活性。有實驗研究藏藥鐮狀棘 豆總黃酮(TF0F)對肝癌細胞SMMC-7721凋亡作用的影響。
[0004]反義技術的基本原理就是根據堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定互 補的DNA或RNA片段(反義核酸）以抑制或封閉專一靶基因表達的技術，有理由發展成為一種 新的基因治療藥物。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種hTERT基因全硫代修飾反義寡核苷酸(ASPS-0DN)，其可以對氟 它胺耐受型前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性產生影響，另外，本發明還提供一種藥物組合 物，反義寡核苷酸與鐮狀棘豆總黃酮（TFOF)，ASPS-0DN對端粒酶活性抑制作用可以對 TF0F誘導氟它胺耐受型(雄激素非依賴型)前列腺癌細胞LNCaP凋亡產生增敏作用。
[0006]根據本發明的第一個方面： 一種前列腺癌細胞hTERT基因反義寡核苷酸，其核苷酸序列為：5 ' -GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3' 〇
[0007]所述的反義寡核苷酸上的所有堿基是經過硫代修飾的。
[0008]根據本發明的第二個方面： 一種用于治療氟它胺耐受型前列腺癌的組合物，包括有權利要求1所述的反義寡核苷 酸，以及鐮狀棘豆總黃酮(TF0F)。
[0009]根據本發明的第三個方面： 包含有上述組合物的藥物，所述的藥物是以水為載體，其中反義寡核苷酸的濃度是5~ 20_〇1/1，鐮狀棘豆總黃酮的濃度是0 · 05~0 · 2g/L。
[0010] 根據本發明的第三個方面： 上述的反義寡核苷酸在制備治療氟它胺耐受型前列腺癌藥物中的應用。
[0011] 根據本發明的第四個方面： 上述的組合物在制備治療氟它胺耐受型前列腺癌藥物中的應用。
[0012]有益效果:hTERT基因反義核酸對TF0F誘導的氟它胺耐受型前列腺癌細胞LNCaP-flu凋亡有增敏作用。
【附圖說明】
[0013]圖1 hTERT基因反義核酸與0.1g/L TF0F聯合作用48h對LNCaP-flu細胞活力的影響。
[0014] 圖2空白樣本的流式細胞儀檢測散點圖。
[0015]圖3SPS-0DN樣本的流式細胞儀檢須撒點圖。
[0016]圖4ASPS-0DN樣本的流式細胞儀檢須撒點圖。
[0017]圖5TF0F樣本的流式細胞儀檢測散點圖。
[0018]圖6TFOF+SPS-0DN樣本的流式細胞儀檢測散點圖。
[0019]圖7TFOF+ASPS-0DN樣本的流式細胞儀檢須撒點圖。
[0020]圖8 hTERT反義核酸與TF0F0.1g/L聯合作用48h，LNCaP-flu細胞凋亡百分率(A:空白；B: S PS-ODN; C: AS PS-ODN; D: TFOF; E: TFOF+S PS-ODN; F: TFOF+AS PS-0DN)〇
【具體實施方式】
[0021 ]實施例1材料和方法 1.1.1主要試劑 RPMI 1640培養粉為北京天為時代科技有限公司產品，胎小牛血清為蘭州民海生物制 品公司產品，臺盼藍為蘭州百奧生物制品公司產品，藏藥鐮狀棘豆總黃酮(TF0F)為武漢博 士德生物制品公司產品。Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒為北京天為時代科技有限公司產 品。
[0022] 1.1.2引物合成 根據hTERT基因mRNA的序列分析，設計出互補于起始密碼子的反義片段共20個堿基長 度作用的靶序列。
[0023] 反義片段hTERTASPS-0DN的序列為5'-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3'（SEQIDN0·l)。
[0024]作為對照的正義片段SPS-0DN的序列為5'-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3'（SEQID N0.2)〇
[0025]以上每條鏈進行堿基全部硫代修飾，由北京賽百勝生物制品公司合成，純化，分 裝。
[0026] 1.1.3細胞培養 LNCaP細胞株由蘭州大學第二醫院泌尿研究所惠贈。采用含10%胎小牛血清(60°C滅活3 min)，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液，在37°C，5%C02飽和濕度條件下 培養。LNCaP細胞含10%FBS的RPMI1640培養液中。羥基氟它胺用無水乙醇溶解后加入磷酸鹽 緩沖液(PBS，常規培養于pH7.2)至羥基氟它胺終濃度為l(T4m〇l/L儲存。LNCaP加入羥基氟它 胺至終濃度為l(T7m〇l/L后連續培養80代，使之成為氟它胺耐受型前列腺癌細胞LNCaP-flu， 實驗選用對數生長期細胞。
[0027] 1.1.4鐮狀棘豆總黃酮的制備 取鐮狀棘豆干藥材l〇〇g，經95%，50%乙醇依次提取，減壓回收乙醇，加2%NaOH溶解，濾 過，濾過液加1%HC1調至pH值為5,以氯仿、乙酸乙酯依次萃取，合并萃取液，濃縮至干，得鐮 狀棘豆總黃酮。將所得總黃酮部位進行純度測定。
[0028] 1 · 1 · 5TF0F樣品的配制 稱取鐮狀棘豆總黃酮適量，以無血清DMEM培養基為基質，二甲基亞砜(DMS0)助溶，DMS0終濃度為0.5%。過濾除菌，4°C保存備用。
[0029] 1.1.6統計學分析方法數據采用均數+標準差表示，使用SPSS16.0統計學軟件， 采用單因素方差分析進行統計學處理，以P〈〇. 05確定為有統計學意義。
[0030] 1.1.7hTERTASPS-0DN最適作用濃度的選擇 實驗分為ASPS-0DN組，SPS-0DN組及空白對照組。采用24孔培養板，每組接種3孔，每 孔接種1X105細胞。寡核苷酸濃度分為4組，第1天向培養液中分別加入5，10，15,20μ