一種特異性抑制magea1基因表達的小干擾rna及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及基因工程技術領域，具體地說涉及一種特異性抑制MAGEA1基因表達的 小干擾RNA及其應用。
【背景技術】
[0002] RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術是指是指在進化過程中高度保守的、由雙 鏈RNA(double_strandedRNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象，RNA分子通 過破壞特定的mRNA，以抑制某種基因表達的生物學過程。該技術具有以下幾點優勢：1高效 性;2特異性;3位置效應;4高穩定性;5可傳播性;6濃度時間依賴性。由于使用RNAi技術可以 特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術迅速成為基因功能研究和基因治療研究領域最 受關注的研究工具之一，已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領 域。
[0003] 惡性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM):是源自于黑色素細胞的一種惡性腫瘤， 好發于皮膚，惡性程度高，治療難度大。雖然黑素瘤僅占全部皮膚腫瘤的4%，但卻占皮膚腫 瘤死亡人數的80%，是皮膚腫瘤中死亡率最高的一種惡性腫瘤。美國國家癌癥研究所(NCI) 的數據顯示，在2003-2007年間，患病人數為每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估計有 68130個患者被診斷患有黑色素瘤，其中8700個患者將因此喪生（http:// www.cancer.gov/)。惡性黑色素瘤的發生率在全世界范圍內正在不斷地上升，包括以前發 病率低的地區，它已成為一種嚴重威脅人們健康的惡性疾病。在中國黑色素瘤患者有逐年 增高的趨勢。北京市八城區統計資料顯示，2000年MM發病率為0.2例/10萬，到了2004年已達 1例/10萬。根據中國臨床腫瘤協會(CSC0)黑色素瘤專家委員會發表的《中國黑色素瘤診治 指南（2011版）》，我國每年新發病例約2萬例，已經成為了嚴重危及我國人民健康的疾病之 〇
[0004] MelanomaantigenfamilyAl(MAGEAl)是MAGE基因家族成員之一，該家族共有12 個同源基因，編碼蛋白序列具有50%-80%的相似性，而啟動子區和第一外顯子區差異相對 比較大。MAGEA1是1991年由VanderBruggeon等人從一例患有黑色素腫瘤但是臨床表現良 好的病人身上所分離得到的。MAGEA1基因所編碼的蛋白能夠被人體毒性T淋巴細胞克隆 (CTL克隆）識別。MAGEA1基因所編碼的蛋白可以與SKIP蛋白發生相互作用并且通過招募組 蛋白去乙酰酶(HDAC-1)，從而調控某些特定基因的轉錄。MAGEA1染色質定位于人類X染色體 q28區域，該基因全長1755bp，主要由3個外顯子和2個內含子組成。編碼蛋白309個氨基酸長 度，一般認為MAGEA1在細胞內主要分布在細胞核和錨定在細胞膜上，正常情況下，MAGEA1僅 在雄性生殖系統和胎盤表達，通常在惡性腫瘤細胞中不表達，其原因是該基因的啟動予處 CpG島的甲基化。近年來研究發現在多種腫瘤當中，包括黑素瘤、乳腺癌、神經母細胞瘤、膀 胱癌以及非小細胞肺癌中也存在MAGE-A1基因的表達，因此MAGEA1被稱作癌癥生殖 (cancer-germline，CG)基因或者腫瘤睪丸抗原（cancer-testisantigen，CTA)基因。 MAGEA1編碼的蛋白在腫瘤細胞表面可被細胞毒性T淋巴細胞識別，經過抗原遞呈以及機體 免疫應答，產生體液免疫和細胞免疫的應答效應，因此MAGEA1基因被視為潛在的腫瘤疫苗 靶點。
[0005]由于當前對MAGEA1的研究進展有限，其在生殖系統和腫瘤中的生物學功能還不是 非常清楚，但可以肯定的是，MAGEA1編碼的分子參與了多種分子功能調節并發揮一系列作 用。下調MAGEA1的表達，可以有效抑制腫瘤細胞的迀移和侵襲能力，目前針對下調MAGEA1的 表達研究，特別是特異性抑制MAGEA1表達的小干擾RNA報道較少。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種能夠特異性抑制MAGEA1基因表達的小干擾RNA (siRNA)及其應用。
[0007] 本發明根據RNAi發生原理，設計并合成了針對MAGEA1基因的小干擾RNA，其GC含量 為42.11%，且正義鏈和反義鏈的長度均為19nt。
[0008] 進一步地，本發明的小干擾RNA雙連體分子的正義鏈和反義鏈序列分別為：
[0009]正義鏈：5 'GAGUAUGUGAUCAAG⑶CAdTdT-3 '，（SEQIDN0 ·1)
[0010] 反義鏈：5'-dTdTCUCAUACACUAGUUCCAGU-3'（SEQIDN0.2)。
[0011] 本發明提供的上述小干擾RNA，能夠特異性下調細胞或生物體中MAGEA1基因的表 達量。
[0012] 進一步地，本發明的小干擾RNA作用于MAGEA1基因的靶序列為：5'_ GAGTATGTGATCAAGGTCA-3'（SEQIDN0.3)。
[0013] 一種編碼本發明所述小干擾RNA的DNA序列屬于本發明的保護范圍。
[0014]本發明提供一種表達載體，其包含編碼上述小干擾RNA的DNA序列。
[0015] -種宿主細胞，其為可表達本發明所述小干擾RNA的細胞。
[0016] 一種含有上述小干擾RNA的藥物屬于本發明的保護范圍。
[0017]進一步地，所述的藥物為抗腫瘤的藥物。所述的腫瘤為黑色素瘤、乳腺癌、神經母 細胞瘤、膀胱癌、非小細胞肺癌、大腸癌、胃癌、肝癌、精原細胞瘤、食道癌、白血病、淋巴瘤、 肉瘤。
[0018]進一步地，所述的藥物為免疫治療劑。
[0019] -種可表達上述小干擾RNA的細胞系也屬于本發明的保護范圍。
[0020] 本發明提供了上述小干擾RNA在制備調節細胞或生物體中的MAGEA1基因表達藥物 中的用途。
[0021] 本發明提供了上述小干擾RNA在制備抑制腫瘤細胞迀移和侵襲的藥物中的用途。
[0022] 優選地，所述腫瘤細胞為黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、神經母細胞瘤細胞、膀胱癌 細胞、非小細胞肺癌細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、精原細胞瘤細胞、食道癌細胞、 淋巴瘤細胞、肉瘤細胞。
[0023]本發明提供了上述小干擾RNA在制備治療疾病的藥物中的用途，所述的疾病為黑 色素瘤、乳腺癌、神經母細胞瘤、膀胱癌、非小細胞肺癌、大腸癌、胃癌、肝癌、精原細胞瘤、食 道癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤。
[0024]有效的靶向治療是目前國內外不斷尋找的輔助治療方法，本發明提供的靶向針對MAGEA1基因的siRNA轉染黑色素瘤細胞后，發現siRNA能夠顯著下調MAGEA1基因的表達，有 效抑制腫瘤細胞的迀移和侵襲能力，對于開發新的抗腫瘤基因藥物和腫瘤藥物的治療效果 具有重要指導作用，可用于開發制備抗腫瘤藥物，將會取得巨大的社會效益和經濟價值。
【附圖說明】
[0025]圖1為本發明的siRNA對A375細胞MAGEA1基因表達的敲低效果。其中1:未轉染siRNA的A375細胞;2:轉染陰性對照序列的A375細胞;3:轉染siRNA的A375細胞。
[0026]圖2為A375細胞中MAGEA1基因mRNA敲低水平的電泳檢測結果，其中泳道1:分子量 標記;泳道2:轉染siRNA的A375細胞;泳道3:轉染陰性對照序列的A375細胞;泳道4:未轉染 siRNA的A375細胞。
[0027] 圖3為A375細胞MAGEA1蛋白敲低水平的Westernblot檢測，其中泳道1:未轉染siRNA的A375細胞;泳道2:轉染陰性對照序列的A375細胞;泳道3:轉染siRNA的A375細胞。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或