一種中國人口腔黑色素瘤細胞系comm-1及其建立方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于細胞工程領域，具體涉及一株中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1及其 建立方法。
【背景技術】
[0002] 1.1 口腔黑色素瘤的發病及預后
[0003] 惡性黑色素瘤源于神經脊細胞，是侵襲性最強的惡性腫瘤之一。原發性口腔黑色 素瘤是一種罕見疾病，約占口腔惡性腫瘤〇. 5 %及口腔活檢組織0.01 %。該疾病多發于41-60歲之間，男女比例為2:1，患者在患病初期未見明顯癥狀，大部分口腔黑色素瘤在確診時 已進入晚期，可見腫瘤塊大于4mm。口腔黑色素瘤嚴重影響患者味覺，預后較差，5年生存率 僅為 15-20 %。
[0004] 1.2細胞系的建立
[0005]建立腫瘤細胞系是研究腫瘤致關重要的環節。細胞系廣泛應用于生物學各個研究 領域。它是指直接從生物體的組織中分離培養出細胞，為后續研究提供穩定細胞系的一種 方法。細胞系是研究特定細胞的生長、代謝、調控特性，細胞與細胞間相互作用，細胞與基質 的相互作用等有效的研究材料。人類的第一株連續細胞系是1951年由GeorgeOttoGey實 驗室建立的子宮頸癌細胞系（Hela)，這株細胞系的建立是人體細胞體外培養的里程碑， Hela細胞推進了細胞、基因、病毒、疫苗等許多研究領域的進程，也加深了人們對腫瘤的認 識:發現腫瘤的各種特性、研究腫瘤發生發展的原因和過程、篩選抗癌藥物等。
[0006]除了研究細胞本身的特性和癌癥的發生發展外，還應用于遺傳、免疫、分化、發育 的研究領域。此外，國內外不少企業還可以利用細胞進行生產各種因子、蛋白等。細胞的廣 泛應用推動了細胞生物學的蓬勃發展。
[0007]原代培養主要有機械法和酶消化法。機械法主要是利用物理剪切，直接將組織剪 碎，然后將這些組織小塊貼壁培養的方法。酶消化法是應用適當的酶裂解組織從而分離出 單細胞，直接懸浮或貼壁培養的方法。用于消化的酶主要有:胰蛋白酶、膠原酶、鏈酶蛋白 酶、透明質酸酶等。
[0008] 癌細胞的體外建系難度較大，一是要有效預防和去除支原體、霉菌及細菌等的污 染;二是要保證細胞生存環境如血清，培養基，生長因子等的質量;三是有效控制纖維細胞 的生長；四是必須控制好前10代細胞的傳代與保種。雖然70年代Moore等相繼建立了HT-144Melanoma，RPMI-7951等黑色素瘤細胞系，但來源不同的黑色素瘤其生物學特性各異，且 這些細胞系在體外生存時間過長，其生物學特性與體內實體瘤相比較有較大差異，難以客 觀反映體內實體瘤的情況，因此，建立體外培養的黑色素瘤細胞系，能為基礎研究與臨床 治療提供豐富的實驗材料，對于探討其發病機制，尋找新的治療手段意義重大。
[0009] 1.3黑色素瘤干細胞的研究
[0010]近年來隨著對腫瘤研究的不斷進展，針對一些復發腫瘤和對放射性、化學治療不 敏感提出了腫瘤干細胞(cancerstemcell，CSC)的概念，該學說認為腫瘤細胞具有異質 性，同一腫瘤中，大部分細胞高分化的細胞已經失去了生長分化潛能，只有一小部分細胞具 有無限增殖、分化和體外克隆的能力。
[0011] 區分CSC的基本特點主要包括:一是將腫瘤移植到免疫缺陷小鼠時，腫瘤中只有很 少一部分細胞是腫瘤干細胞，較少的癌細胞就能使小鼠致瘤。二是CSC與非CSC可通過獨特 的細胞表面標志物用流式的方法富集細胞。三是CSC具有自我更新能力可以通過多代的連 續傳代和移植實驗證實。
[0012] 惡性黑色素瘤親代細胞在添加生長因子的獨特無血清培養基中懸浮培養后部分 細胞形成懸浮生長的腫瘤細胞球，目前已經被實驗證實的黑色素瘤細胞表面標志物是 CD20、CD271、JARID1B、ABCB5、ABCG2等。CD20是第1個被發現的惡性黑色素瘤干細胞的表面 標志物，CD20+黑色素瘤細胞亞群具有多能性和多向分化能力，具有體外自我更新能力和致 瘤性，可以通過體外誘導成為神經祖細胞。CD271是低親和性神經生長因子受體，也是神經 脊細胞的表面標志物，CD271被認為與黑色素瘤細胞的外周神經的侵襲和轉移相關，CD271 大約占黑色素瘤亞群的2.5%_41%<JARID1B是一個組蛋白脫甲基酶，具有促進腫瘤持續增 殖、自我更新和多能性。JARID1B在正常組織中低表達或不表達，而在再生能力強的黑色素 痣組織異常高表達，但是JARID1B陽性細胞僅占δ^?-ΙΟ^^ΑΤΡ結合盒式蛋白（ATP-binding cassettetransporter，ABC)是古老而龐大的家族，是一類ATP驅動栗，ABC家族蛋白水解 ATP產生能量用以轉運各種物質，ABCG2和ABCB5被認為在具有黑色素瘤干性的細胞中表達。
【發明內容】
[0013] 本發明提供了一種中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1及其建立方法。
[0014]首先，本發明提供了一種中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1，所述中國人口腔黑 色素瘤細胞系⑶麗-1保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，其保藏號為CCTCC: C201586，其保藏日期為2015年6月8日，保藏地址為武漢大學。
[0015] 進一步本發明提供了一種中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1的建立方法，包括如 下具體步驟：
[0016]a)采用組織塊貼壁法進行口腔黑色素瘤細胞的原代培養；
[0017]b)當細胞密度達到約80 %時進行傳代培養，傳代比例為1:3;
[0018]C)將傳代穩定的細胞經RT-PCR檢測mRNA表達的狀況。
[0019] 進一步地，所述步驟C)中，檢測的rnRNA黑色素瘤細胞系、神經脊來源細胞腫瘤抗原mRNA〇
[0020]進一步地，所述步驟C)中，檢測的mRNA為Melan-A、TYR、MITF。
[0021 ]所述的中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1的建立方法，步驟a)的具體方法為：[0022] 1)1%1型膠原包被培養皿培37°C培養箱靜止30min，冷1XPBS洗皿兩次，待用；
[0023]2)配置培養液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘；
[0024]3)在超凈臺中取出黑色素瘤組織，先去除表面脂肪和上皮組織，75%酒精消毒不 超過10秒，在1 X PBS中浸泡，放到培養液中；
[0025] 4)將組織剪成小碎塊，均勻分種入培養皿中，加入適量培養液，使組織一半浸于培 養液中；
[0026] 5)置于37°C，5 %C02的培養箱中培養；
[0027] 6)第二天補充適量培養液至稍稍浸沒組織塊；
[0028] 7)視細胞生長情況進行適當換液。
[0029]所述的中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1的建立方法，步驟b)的具體方法為：
[0030] 1)棄培養液，用1 X PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；
[0031] 2)加入血清終止消化；
[0032] 3)吹打細胞，置于離心管中，加入適量的培養液吹打；
[0033] 4)離心1000rpm，5分鐘；
[0034] 5)棄上清，加入適量培養液吹打散；
[0035] 6)將細胞懸液加入新的培養皿中，得到所述中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1。
[0036]本發明的內容還包括所述的中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1在研究治療人口 腔黑色素瘤的藥物中的用途。
[0037 ]本發明的內容還包括所述的中國人口腔黑色素瘤細胞系COMM-1在制備人口腔黑 色素瘤的藥物中的用途。
[0038]本發明的內容還包括所述的中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1在篩選人口腔黑 色素瘤的藥物中的用途。
[0039]本發明的有益效果為:本發明建立了中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1，并用該 細胞系實現了腫瘤干細胞的富集，為研究人中國人口腔黑色素瘤的特性及其治療藥物提供 了物質基礎。
[0040]為了更好地理解和實施，下面結合附圖詳細說明本發明。
【附圖說明】
[0041]圖1、C0MM_1組織HE染色
[0042]圖2、光鏡下觀察原代細胞和C0MM-1傳代細胞系的細胞形態。
[0043]圖3、透射電鏡下觀察C0MM-1細胞的超微結構圖。
[0044] 圖4、瓊脂糖凝膠檢測C0MM-1的MAGE1、S100B、MITF的mRNA的表達情況。
[0045]圖5、C0MM_1細胞染色體核型顯微圖（a)和染色體個數統計圖（b)。
[0046] 圖6、C0MM_1細胞的生長曲線
[0047] 圖7、C0MM_1細胞的克隆形成
[0048]圖8、黑色素瘤細胞C0MM-1中腫瘤干細胞的富集
[0049]圖9、腫瘤干細胞干性基因檢測
[0050]本發明中的一種中國人口腔黑色素瘤細胞系C0MM-1保藏于中國典型培養物保藏 中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC: C201586，其保藏日期為2015年6月8日