一種高效富集血小板的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種高效富集血小板的方法。
【背景技術】
[0002] 血小板是一種具有較小體積的無核細胞，小于紅細胞和白細胞，只存在于哺乳動 物血液中，在正常血液中有較恒定的數量(如人體全血中血小板濃度為1~3 X105/ml)，其 除了可以在止血的時候提供凝聚作用外，還能通過胞內α顆粒的脫顆粒作用釋放大量細胞 生長因子，包括血小板源性生長因子(PDGF)、轉化生長因子-iKTGF-β)、類胰島素生長因子-l(IGF-l)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等，可誘導骨細胞的分裂 增殖及膠原合成，促進骨組織的修復與重建。血小板可從患者自身全血中提取，經富集處理 后發揮治療作用，具有來源豐富，取材方便，分離簡單等特點，廣泛應用于骨科、口腔科、運 動醫學等領域。
[0003] 現有的血小板人工富集方法主要采用富血小板血漿(PRP)法，得到PRP用于實驗研 究和臨床治療。PRP是全血經過離心分離得到的血小板濃縮物，其制備原理是利用血液中各 種成分沉降速度不同，通過離心將血液分層。全血經低速離心可分為三層，上層是貧血小板 血漿層(PPP)、中間為富血小板血漿層(PRP)、下層為紅細胞層，取中間層可得到高度濃縮的 含血小板血漿。
[0004]現有技術例如富血小板血漿(PRP)法主要都是采用從人血里面直接提取血小板， 但這樣收集得到的血小板的數量有限，并且直接回輸血小板后，血小板的增加值低于預期 的回升值，即出現血小板輸注無效的現象；同時，直接向人體輸注血小板也不可避免地增加 了血源性感染及輸血反應發生的概率，并且我國各大城市的血小板供應存在極大的缺口， 因此，臨床上急需一種新的替代治療法來有效的治療血小板減少癥。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有技術中存在的問題，提供一種能較快恢復患者血小板數目及功能 的高效富集血小板的方法，其不僅臨床安全性高，而且可以減少同種免疫抗體的產生，降低 輸血量及血源性感染的危險。
[0006]本發明通過以下技術方案實現該目的：
[0007] -種高效富集血小板的方法，將臍血中的巨核細胞分離并進行培養，然后輸注入 人體內產生大量血小板，每個巨核細胞平均能夠產生2000個血小板。
[0008]其中，巨核細胞分離培養包括巨核細胞的擴增培養以及巨核細胞懸液的制備步 驟。
[0009]作為優選的，所述巨核細胞的擴增培養包括以下步驟：
[0010] 1)用抗凝采血管采集臍血，將l〇〇ml臍血與濃度為0.06g/ml羥乙基淀粉混合，臍血 與羥乙基淀粉的體積比為3~6:1，充分混勻后靜止30min以上，沉降紅細胞，吸取上清液，并 加至裝有等體積的淋巴細胞分離液的離心分離管中，2000rpm離心20min，收集單個核細胞；
[0011 ] 2)將收集到的單個核細胞用PBS洗滌，1500rpm離心lOmin，重復2次；
[0012] 3)將洗滌后的單個核細胞按密度為1X106接種于MDM培養基中，并加入濃度為50 ~100ng/ml的rhG-CSF，連續培養7天；
[0013] 4)將上述步驟3)中的單個核細胞收集離心，1500rpm離心lOmin后，用StemSpan SFEM無血清培養基重懸，并加入細胞生長因子SCF20~100ng/mL、20~100ng/mLTP0、10~ 50ng/mLIL-3、20~100ng/mLIL-6、20~100ng/mLIL-11、10~50IU/ml肝素，置于37°C、 5 %⑶2、5 %02、90 %N2的條件下培養，每隔2天進行原體積的1/3量的換液，連續培養4~10 天；
[0014]所述巨核細胞懸液的制備包括以下步驟：
[0015] 5)將上述培養11~17天的巨核細胞進行收集，1500rpm離心5min，棄上清；
[0016] 6)將步驟5)獲得的巨核細胞用生理鹽水重懸，離心1500rpm離心5min，棄上清；
[0017] 7)最后將收集到的巨核細胞重懸于生理鹽水中，制備成巨核細胞懸液。
[0018]進一步的，對步驟2)收集的單個核細胞進行計數，單個核細胞數量為（0.85 ± 0.42)X108個，其中巨核細胞占比0.5 %左右，取1.0X108個單核球細胞，含巨核祖細胞約 (2·82±0·35)X105個。
[0019] 進一步的，所述步驟3)中經過rhG-CSF刺激培養后，CD34+細胞的含量明顯提高10 倍左右，達到（2.62±0.57)X106個。
[0020] 進一步的，所述步驟4)中連續培養4~10天后，⑶34+細胞總數擴增了35.21 ± 1.24 倍，其中巨核細胞占細胞總數的70 %，S卩（9.23 ± 3.25)X107個。
[0021] 作為優選的，所述步驟7)中將巨核細胞重懸于生理鹽水，制備成200ml的細胞懸 液，每袋細胞總量控制在0.5~1X107個。
[0022] 相對于現有技術，本發明的有益效果為:本發明的高效富集血小板的方法，采用的 是先誘導擴增臍血里的巨核細胞，待得到較成熟的巨核細胞后再回輸到人體內，每個巨核 細胞在人體內平均能產生2000個血小板，能夠快速恢復患者血小板數目及功能，該方法不 僅臨床安全性高，而且可以減少同種免疫抗體的產生，降低輸血量及血源性感染的危險。
【具體實施方式】
[0023]以下結合具體實施例對本發明進行詳細描述。
[0024] 實施例1。
[0025]本實施例提供一種高效富集血小板的方法，包括巨核細胞的擴增培養以及巨核細 胞懸液的制備步驟。
[0026]其中，所述巨核細胞的擴增培養包括以下步驟：
[0027] 1)用抗凝采血管采集臍血，將100ml臍血與濃度為0.06g/ml羥乙基淀粉混合，臍血 與羥乙基淀粉的體積比為3:1，充分混勻后靜止30min以上，沉降紅細胞，吸取上清液，并加 至裝有等體積的淋巴細胞分離液的離心分離管中，2000rpm離心20min，收集單個核細胞； [0028] 2)將收集到的單個核細胞用PBS洗滌，1500rpm離心lOmin，重復2次；
[0029] 3)將洗滌后的單個核細胞按密度為1X106接種于IMDM培養基中，并加入濃度為 50ng/ml的rhG-CSF，連續培養7天；
[0030] 4)將上述步驟3)中的單個核細胞收集離心，1500rpm離心lOmin后，用StemSpan SFEM無血清培養基重懸，并加入細胞生長因子SCF、TPO、IL-3、IL-6、IL-11和肝素，其終濃度 分別為2〇1^/1111^、2〇1^/1111^、10叫/1111^、2〇1^/1111^、20叫/1111^、1011]/1111^，置于37。〇、5%〇〇2、5%〇2、 90%N2的條件下培養，每隔2天進行原體積的1/3量的換液，連續培養4天；
[0031 ]所述巨核細胞懸液的制備包括以下步驟：
[0032] 5)將上述培養11天的巨核細胞進行收集，1500rpm離心5min，棄上清；
[0033] 6)將步驟5)獲得的巨核細胞用生理鹽水重懸，離心1500rpm離心5min，棄上清；
[0034] 7)最后將收集到的巨核細胞重懸于生理鹽水中，制備成200ml的細胞懸液，每袋細 胞總量控制在0.5~IX107個。
[0035] 實施例2。
[0036]本實施例提供一種高效富集血小板的方法，包括巨核細胞的擴增培養以及巨核細 胞懸液的制備步驟。
[0037]其中，所述巨核細胞的擴增培養包括以下步驟：
[0038] 1)用抗凝采血管采集臍血，將100ml臍血與濃度為0.06g/ml羥乙基淀粉混合，臍血 與羥乙基淀粉的體積比為6:1，充分混勻后靜止30min以上，沉降紅細胞，吸取上清液，并加 至裝有等體積的淋巴細胞分離液的離心分離管中，2000rpm離心20min，收集單個核細胞； [0039] 2)將收集到的單個核細胞用PBS洗滌，1500rpm離心lOmin，重復2次；
[0040] 3)將洗滌后的單個核細胞按密度為1X106接種于IMDM培養基中，并加入濃度為 100ng/ml的rhG-CSF，連續培養7天；
[0041 ] 4)將上述步驟3)中的單個核細胞收集離心，1500rpm離心lOm