從外周血提取免疫細胞的方法

從外周血提取免疫細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于從外周血提取免疫細胞的方法。
【背景技術】
[0002]從人的外周血中提取免疫細胞，不僅在治療癌癥方面有較好的前景，而且從健康養生的角度來看，也可以在患者本人健康時提取從其外周血中提取免疫細胞，并在以后患者本人出現免疫低下或其他癥狀時，可以將存儲的免疫細胞回輸給患者本人，提高患者的免疫力。目前主要是利用低溫凍存技術保存外周血的單個細胞，在需要時復蘇并誘導培養為各種免疫細胞。但在分離、凍存過程中，會對單個細胞產生損傷，甚至毒性，尤其是凍存過程中會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環境，同時伴隨生物性損傷的危險。
[0003]現有技術中，常規的Ficoll400分離液對細胞具有一定的毒性，不利于臨床應用，而細胞凍存復蘇后的存活率通常在70%-90%之間。細胞凍存復蘇后的存活率可能會受到細胞采集、分離、凍存等過程的影響。因此，為提供足夠量的淋巴細胞，現有技術中細胞凍存復蘇后的存活率仍需進一步提高，同時也應避免回輸給患者時出現惡心、嘔吐或過敏等不良反應，提尚安全性。
[0004]因此，有必要提供一種能夠有效提高免疫細胞分離率和細胞凍存復蘇后的存活率、提高回輸到患者的細胞的安全性的提取方法。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種能夠有效提高免疫細胞分離率和細胞凍存復蘇后的存活率、提高回輸到患者的細胞的安全性的從外周血提取免疫細胞的方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明提供技術方案如下:
[0007]—方面，提供一種從外周血提取免疫細胞的方法，包括如下步驟:
[0008]1)外周血的預處理:將加入抗凝劑的外周血移入離心管中，750g，10min離心，吸取上層血漿備用，下層細胞加入等體積的PBS溶液，混勻獲得細胞懸液；
[0009]2)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和泛影酸鈉的分離液加入到離心管中；
[0010]3)將所述細胞懸液平鋪到所述離心液上，在8-25°(3，50(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取白膜層細胞獲得免疫細胞；
[0011]4)將所述免疫細胞等體積加入到凍存液中混勻，分裝于細胞凍存管中，將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。
[0012]進一步地，所述步驟4)中凍存液的配方為10 %DMS0+5%右旋糖酐+5%海藻糖+18%所述上層血漿+62%注射用生理鹽水的混合溶液。
[0013]進一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標準的右旋糖酐3?5重量份，海藻糖2?4重量份，超低粘度海藻酸鈉0.3?0.8重量份，泛影葡胺1?3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.1?0.15重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0014]本發明選用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品;海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以1，1_糖苷鍵構成的非還原性糖，對多種生物活性物質具有非特異性保護作用，對單個核細胞起到一定的保護作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細胞的沉淀;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強陽離子聚電解質有助于紅細胞的沉淀;本發明的分離液中的各組分配比合理從而起到良好的分離效果。
[0015]進一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標準的右旋糖酐3.5?4.5重量份，海藻糖2.5?3.5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.4?0.8重量份，泛影葡胺1.5?2.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.12?0.15重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0016]優選地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標準的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸鈉0.7重量份，泛影葡胺2重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.13重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0017]優選地，所述右旋糖酐為Dextran7 0。
[0018]進一步地，所述分離液的密度為1.070?1.090g/cm3，滲透壓為275?300smol/kg，pH為6?9，粘度為3.0?5.0cp。
[0019]綜上所述，本發明的有益效果表現為:
[0020]本發明從預處理到分離再到凍存均選用符合靜注級原料藥標準的原料，原料不確定性小，安全性高;本發明先將外周血細胞離心，上層血漿作為凍存液的一部分，有效減少回輸過程的免疫排斥反應，下層細胞用PBS稀釋，不僅可以起到洗滌細胞的作用，也可以提高后續的分離效果;本發明的分離液對血液樣品進行離心處理后，淋巴細胞與單核細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶，而紅細胞、粒細胞等其他細胞在離心力及本發明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質層;本發明選用的海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構成的非還原性糖，對多種生物活性物質具有非特異性保護作用，對單個核細胞起到一定的保護作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細胞的沉淀;本發明的凍存方法使用自體血漿有效減少外源物質引起的免疫不適反應。
【具體實施方式】
[0021]為使本發明的實施例要解決的技術問題、技術方案和優點更加清楚，下面將結合具體實施例進行詳細描述。但本發明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發明較好的實施例，僅僅用以解釋本發明，并不能因此而理解為本發明專利范圍的限制。應當指出的是，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
[0022]實施例一
[0023]1)外周血的預處理:將加入抗凝劑的外周血移入離心管中，750g，10min離心，吸取上層血漿備用，下層細胞加入等體積的PBS溶液，混勻獲得細胞懸液；
[0024]2)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和泛影酸鈉的分離液加入到離心管中；
[0025]3)將所述細胞懸液平鋪到所述離心液上，在8-251，50(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取白膜層細胞獲得免疫細胞；
[0026]4)將所述免疫細胞等體積加入到凍存液中混勻，分裝于細胞凍存管中，將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。
[0027]其中，步驟4)中凍存液的配方為10 %DMS0+5 %右旋糖酐+5 %海藻糖+18 %上層血漿+62%注射用生理鹽水的混合溶液;分離液的制備方法為:在具備局部百級層流凈化條件的環境下，在20°C下，將符合藥用標準的右旋糖酐3g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸鈉0.8g，泛影葡胺lg，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.15g充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液1 OOmL，再經過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
[0028]實施例二
[0029]1)外周血的預處理:將加入抗凝劑的外周血移入離心管中，750g，10min離心，吸取上層血漿備用，下層細胞加入等體積的PBS溶液，混勻獲得細胞懸液；
[0030]2)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和泛影酸鈉的分離液加入到離心管中；
[0031]3)將所述細胞懸液平鋪到所述離心液上，在8-251，50(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取白膜層細胞獲得免疫細胞；
[0032]4)將所述免疫細胞等體積加入到凍存液中混勻，分裝于細胞凍存管中，將所述細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉入液氮中凍存。
[0033]其中，步驟4)中凍存液的配方為10 %DMS0+5 %右旋糖酐+5 %海藻糖+18 %上層血漿+62%注射用生理鹽水的混合溶液;分離液的制備方法為:在具備局部百級層流凈化條件的環境下，在20°C下，將符合藥用標準的右旋糖酐5g，海藻糖2g，超低粘度海藻酸鈉0.3g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化銨0.lg充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100mL，再經過0.22μπι濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
[0034]實施例三
[0035]1)外周血的預處理:將加入抗凝劑的外周血移入離心管中，750g，10min離心，吸取上層血漿備用，下層細胞加入等體積的PBS溶液，混勻獲得細胞懸液；
[0036]2)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和泛影酸鈉的分離液加入到離心管中；
[0037]3)將所述細胞懸液平鋪到所述離心液上，在8-251，50(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取白膜層