聚乙烯醇微載體及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種聚乙烯醇微載體及其制備方法與應用，具體為以聚乙烯醇為骨架 材料的用于貼壁哺乳動物細胞培養用的微載體及其制備方法。將聚乙烯溶液乳化成微米級 液滴，經適當交聯、篩分得到一定粒徑范圍的微球，其可不經修飾直接用于貼壁哺乳動物細 胞的發酵培養。聚乙烯醇價格低廉，對環境友好，生物相容性好，以其制備的微載體適合哺 乳動物細胞貼壁生長。本發明的微載體可廣泛應用哺乳動物貼壁細胞發酵生產酶、生長因 子、疫苗和單克隆抗體等生物制品，涉及的技術領域包括生物醫藥、酶工程、發酵工程等。
【背景技術】
[0002] 1967年VanWezel為貼壁依賴性細胞的高產培養提出了微載體培養系統的新技術 概念。經過幾十年的研究改進，微載體培養技術現已廣泛地應用于哺乳動物細胞的培養，已 廣泛用于生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等。
[0003] 基于微載體適用于貼壁依賴性細胞在其表面貼壁生長，微載體能成為迄今常用而 有效的哺乳動物細胞培養載體，除了由于許多工程依賴貼壁細胞系生產的限制外，還因微 載體具有以下的優點兼具單層培養和懸浮培養的優勢，且是均相培養;@細胞所處環 境均一;③環境條件(溫度、pH、C02等)容易測量與監控;1)具有較高的比表面;⑤培養操作 可系統化、自動化，降低了污染發生的機會。
[0004] 目前市面上銷售的微載體從材料上可分為：葡聚糖微載體（比如GE的Cytodex系 列）、聚苯乙稀微載體（比如Pall公司的Solohill、Corning公司的Synthemax)、明膠微載體 (比如？61'〇61113;[0171:;^3 413公司的(]1111:丨8口1161')和纖維素微載體（比如1(;[1'；[11公司的 Ce11snow、Pharmac ia公司的Cy topore)等。從表面修飾材料可分為：帶正電的己二胺（比如 GE的Cytodex1)、哺乳動物膠原（比如GE的Cytodex、PALL公司的Solohill)、人纖連蛋白 (比如PALL公司的Solohill(ProNectin F coated))。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種聚乙烯醇微載體及其制備方法與應用。將聚乙烯醇溶 液乳化成微米級液滴，經適當交聯、篩分得到一定粒徑范圍的微球，其可不經修飾直接用于 貼壁哺乳動物細胞的發酵培養。由于聚乙烯醇價格低廉，對環境友好，生物相容性好，以其 制備的微載體適合哺乳動物細胞貼壁生長。本發明的微載體可廣泛應用哺乳動物貼壁細胞 發酵生產酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等生物制品的生產等。
[0006] 本發明提供的聚乙烯醇微載體是通過反向懸浮將聚乙烯醇溶液在油相中分散成 球形小液粒，通過交聯劑對聚乙烯醇進行交聯，經過固化、洗滌和篩分步驟得到聚乙烯醇微 球;微載體的粒徑為60~250μπι，微載體的密度為1.02~1.07g/cm3。
[0007] 本發明中所用的聚乙烯醇的醇解度為10%~100%(優選80%~95%)，粘度在10~100 mPa.s(優選15~50mPa.s)在常溫或加熱條件下溶于水中，配制成質量分數為1%~20%(優 選5%~15%)的溶液。
[0008]本發明中所用的交聯劑為雙醛類、雙環氧類、雙酸酐類和雙酰氯類化合物。
[0009]本發明提供的聚乙烯醇微載體的制備方法包括如下步驟： 1) 配制由烷烴、脂肪酸、酯類化物等疏水有機化物和親水親油平衡值(HLB值)小于7的 乳化劑作為油相;pH為1~2(加入無機酸)聚乙烯醇溶液作為水相； 2) 充分攪拌下，將水相緩慢加入油相中形成穩定的小液滴。
[0010] 3)然后加入雙醛類、雙環氧類、雙酸酐類或雙酰氯類的交聯劑，進行反應交聯，固 化聚乙烯醇微球。
[0011] 4 )待聚乙烯醇微球固化成形后，濾出微球，用5~20倍體積的熱水(50~100°C)清 洗3次，再用2~20倍體積的乙醇清洗3次，最后用2~20倍體積的石油醚清洗3次。
[0012] 5)清洗完畢在加熱或真空條件下烘干，去除殘留的有機溶劑。將聚乙烯醇微載體 放入純水中，充分浸泡，最后，先用100目不銹鋼篩網濾掉其中粒徑過大的微球，再用180目 的不銹鋼篩網濾掉其中粒徑過小的微球。
[0013] 6)將得到的微球樣品浸泡于pH=7的磷酸緩沖溶液中（如果需長時間保存也可浸泡 20%的乙醇溶液中）備用。
[0014]通過以上方法制備聚乙烯醇微載體的特點：粒徑為60~250μπι，密度為1.02~ 1.06g/cm3〇
[0015]本發明提供的一種聚乙烯醇微載體的制備方法包括如下步驟： 1)將200g10%的聚乙烯醇溶液加入含有2gspan-80的300mL液體石蠟中，用鹽酸調pH為 1 ~2,40-65°C下，以200 -280rpm速度進行攪拌5-10min; 2)降溫至40°C，以280rpm速度繼續攪拌20-30min;加入50%的戊二醛3.5mL，保持溫 度40°C，以280rpm速度繼續攪拌50-60min;升溫至60°C，繼續攪拌50-60min; 3) 停止反應，濾出微球，用10倍體積的70 ± 10°C熱水清洗3-4次，再用5倍體積的乙醇清 洗3-5次，最后用4-5倍體積的石油醚清洗2-3次。經80°C烘干后，去除殘留的試劑。
[0016] 4)篩分:將得到的聚乙烯醇微載體放入純水中，充分浸泡6-8小時，先用用100目的 不銹鋼篩網進行篩分，去除大于100目篩孔的微載體;余下的微載體用180目不銹鋼篩子對 微球進行篩分，保留大于180目篩孔的微載體，即可得到所需的微載體。
[0017]本發明得到的聚乙烯醇微載體應用哺乳動物貼壁細胞發酵生產酶、生長因子、疫 苗和單克隆抗體等生物制品的生產。
[0018]將聚乙烯醇微球用于細胞培養前，需將其浸泡液更換為新鮮的pH為7的磷酸緩沖 鹽溶液，經121°C濕熱滅菌30~60°C后，可直接加入培養基中用于細胞的發酵培養。
[0019]本發明以聚乙烯醇為原料制備的微載體不需用表面修飾，可直接用于哺乳動物細 胞的發酵培養，制備工藝更加簡單。聚乙烯醇是一種高分子有機化合物，對人體無毒、無副 作用，具有良好的生物相容性。聚乙烯醇在醫療領域具有廣泛使用，可以制成水凝膠，制造 軟性接觸眼鏡;可以制成口腔膜，貼于患處，治療細菌感染;還可以制成醫用海綿，用于手術 中吸液、吸血。聚乙烯醇可通過石油乙烯法、天然氣乙炔法和電石乙炔法等成熟方法進行， 生產方便，易于獲取，價格低廉。另外聚乙烯醇不同于其它乙烯基聚合物（比如聚苯乙烯）， 其可被細菌作為碳源利用，可降解，是一種環境友好的材料。以聚乙烯醇為基質形成的微載 體可不用具有神經毒性的己二胺修飾，更加環保;也不需要用哺乳動物源材料膠原或纖維 蛋白修飾，避免生產過程引入哺乳動物源材料所帶來的生物安全性風險。
[0020]實驗證明，哺乳動物貼壁細胞能在上述制備的以聚乙烯醇為骨架材料的微載體上 進行良好的貼附，適合于哺乳動物細胞的大規模發酵生產。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為聚乙烯醇微球照片（X100)。
[0022] 圖2為濕熱滅菌30min后顯微鏡下觀察（X100)。
[0023] 圖3為濕熱滅菌60min后顯微鏡下觀察（X100)。
[0024]圖4為vero細胞在聚乙烯醇微載體上的貼壁效果（X200)。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例，進一步詳細闡述本發明。實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件;所用的通 用設備、材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。