用于培養病毒的無血清培養液及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種培養液及其制備方法，具體涉及用于培養病毒的無血清培養液及 其制備方法。
【背景技術】
[0002] 1996年以來，哺乳動物細胞培養已經發展到能夠自由擴大培養并且用于工業化 生產。許多生物活性物質、疫苗、載體，如單克隆抗體、藥用蛋白質、高職病性藍耳病疫等， 都可以通過動物細胞大規模培養獲得。通過細胞培養生產生物制品既能提高生物制品的質 量，又能促進細胞培養技術、蛋白質表達純化技術、病毒培養技術等的發展。
[0003] 目前，獸用疫苗很多都需要通過細胞培養來進行生產，在生產過程需要使用血清。 血清培養存在成分不明確;保存期短;取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響， 可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性;制作過程復雜、批間差異大，成分不能保持一致， 使用使得實驗和生產的標準化困難;質量不穩定，價格昂貴，進出口管制影響盈利.，使用不 方便等缺點。而無血清培養可以消除來自血清的不均一性;降低生產成本，簡化分離純化步 驟，避免病毒污染造成的危害;提高了細胞培養的可重復性，避免了由于血清批次之間差異 的影響;供應充足、穩定。因此從當前發趨勢來看無血清培養，是近年世界范圍內各大生物 公司產業化生產的發展方向。
[0004] 中國專利申請201410467191.2公開了無血清培養基及其用途和一種豬瘟病毒的 培養方法，無血清培養基，所述無血清培養基為pH為7.0~7.5的水溶液，其組分如下:MEM 基礎培養基;丙酮酸鈉;大豆蛋白水解物;膽固醇;堿性成纖維細胞生長因子;抑制素B;胰島 素;L-丙氨酸;L-纈氨酸;L-亮氨酸;L-異亮氨酸;L-甲硫氨酸;L-脯氨酸;L-苯丙氨 酸;L-色氨酸;L-甘氨酸;L-絲氨酸;L-蘇氨酸;L-半胱氨酸;L-天冬酰胺;L-谷氨酰 胺;L-酪氨酸;L-天冬氨酸;L-谷氨酸;L-賴氨酸;L-精氨酸;L-組氨酸;羥脯氨酸；豆 蔻酸;棕櫚酸;棕櫚油酸;硬脂酸;精胺;亞精胺;還原型谷胱甘肽；乙醇胺;β-巰基乙醇;甘 油；生物素；吡哆醇；抗壞血酸；維生素Β-12;次黃嘌呤；胸苷;NaH⑶3 ;FeS047H20;ZnS04; Na2Se03;朽1檬酸鐵。該培養基成分復雜，不利于制備，生產成本高。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種生產成本低，易于制備的用于培養病毒的培養液及其 制備方法。
[0006] 為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：用于培養病毒的無血清培養液， 包括DMEM培養基，還包括如下組分及其濃度:胰島素5~45mg/L、牛血清白蛋白0.5~3mg/ mL、微量元素0.1~2mg/L、酵母提取物0.2~3g/L、氨基酸溶液2~5 mg/L、纖連蛋白0.2~ 1.5mg/mL、輔酶R 0.01~0.15mg/L、煙酸0.5~2mg/L和維生素C 0.5~2 mg/L。
[0007] 優選地，所述的用于培養病毒的無血清培養液，包括DMEM培養基，還包括如下組分 及其濃度:胰島素5 mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素0.5mg/L、酵母提取物0.2g/L、 氨基酸溶液2mg/L、纖連蛋白0.2mg/mL、輔酶RO.Olmg/L、煙酸0.5mg/L和維生素C0.5mg/L〇
[0008]優選地，所述的用于培養病毒的無血清培養液，包括DMEM培養基，其特征在于還包 括如下組分及其濃度:胰島素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、微量元素lmg/L、酵母提取物 1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纖連蛋白lmg/mL、輔酶R0.5mg/L、煙酸lmg/L、維生素Clmg/ L〇
[0009]優選地，所述的用于培養病毒的無血清培養液，包括DMEM培養基，其特征在于還包 括如下組分及其濃度:胰島素45mg/L、牛血清白蛋白3mg/mL、微量元素2mg/L、酵母提取物 3g/L、氨基酸溶液5mg/L、纖連蛋白1.5mg/mL、輔酶R0.15mg/L、煙酸2mg/L和維生素C2 mg/L〇
[0010] 優選地，所述氨基酸溶液由以下重量份數的組分組成:甘氨酸0.2~1份、異亮氨酸 0.5~2份、絲氨酸0~1.5份、丙氨酸0.1~1.5份、苯丙氨酸0.1~0.5份、酪氨酸0.1~2份、繳氨酸 0.2~1.5份、脯氨酸0.1~0.5份、半胱氨酸0.5~2份、亮氨酸0~1份、色氨酸0.5~2份、蛋氨酸0.5 ~1.5份、天冬酰胺0.05~0.25份、谷氨酰胺0.5~2.5份、蘇氨酸0.2~1.5份、天冬氨酸0.05~2 份、谷氨酸(M). 5份、賴氨酸0.5~1份、精氨酸0.1~0.5份、組氨酸(M). 5份和蒸餾水5~10份。
[0011] 優選地，所述氨基酸溶液由以下質量百分數計的組分組成:甘氨酸0.5份、異亮氨 酸1份、絲氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、纈氨酸1份、脯氨酸0.2份、 半胱氨酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5 份、蘇氨酸0.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、賴氨酸0.6份、精氨酸0.3份、組氨酸0.3份和 蒸餾水8份。
[0012] 優選地，所述微量元素由硒、銅、鈷、鋅、鎳按1~2:1.5~3:1~1.5: 2~3:1~1.5的重量 比組成。
[0013] 優選地，所述培養液的pH為7.0~7.2。
[0014]本發明還提供了所述的用于培養病毒的培養液的制備方法，包括以下步驟:取配 方量的DMEM培養基溶于1000ml蒸餾水，加入所述胰島素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提 取物、氨基酸溶液、纖連蛋白、輔酶R、煙酸和維生素C，充分混合，調節pH，即得。
[0015] 優選地，所述氨基酸溶液由如下方法制備:取配方量的甘氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、 丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸，然后溶解在配方量的蒸餾 水中，得到氨基酸溶液。
[0016]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明用于培養病毒的培養液，在接種病毒 后，為細胞的培養和擴增中提供了細胞生長所需的足夠的營養物質，并且通過各種成分的 配比，保證其生長分裂情況良好、增殖獲得的細胞完整，經本發明培養液培養的病毒具有效 價高、質量好的優點；此外，該培養液的制備方法簡單、易操作，降低了病毒生產成本，便于 實現大規模生產的需要。
【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0018] 本發明中的各組分均為常規市售產品，例如DMEM培養基為GibcoDMEM干粉培養基 (高糖，含丙酮酸鈉），貨號12800017。
[0019]實施例1:用于培養病毒的無血清培養液。
[0020] -種用于培養病毒的無血清培養液，所述的用于培養病毒的無血清培養液，包括 DMEM培養基，還包括如下組分及其濃度:胰島素5mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素 0 · 5mg/L、酵母提取物0 · 2g/L、氨基酸溶液2mg/L、纖連蛋白0 · 2mg/mL、輔酶R0 · 01mg/L、煙 酸0.5mg/L和維生素C0.5mg/L。
[0021] 其中，所述氨基酸溶液由以下質量百分數計的組分組成:甘氨酸0.2份、異亮氨酸 0.5份、絲氨酸0.2份、丙氨酸0.1份、苯丙氨酸0.1份、酪氨酸0.1份、纈氨酸0.2份、脯氨酸0.1 份、半胱氨酸0.5份、亮氨酸0.2份、色氨酸0.5份、蛋氨酸0.5份、天冬酰胺0.05份、谷氨酰胺 0.5份、蘇氨酸0.2份、天冬氨酸0.05份、谷氨酸0.1份、賴氨酸0.5份、精氨酸0.1份、組氨酸 0.1份和蒸餾水5份;所述微量元素由硒0.1份、銅0.1份、鈷0.1份、鋅0.1份和鎳0.1份組成。 [0022]所述用于培養病毒的無血清培養液的制備方法，包括以下步驟:取配方量的DMEM 培養基溶于l〇〇〇ml蒸餾水，加入所述胰島素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸 溶液、纖連蛋白、輔酶R、煙酸、維生素C，充分混合，調節pH，即得。
[0023]所述氨基酸溶液由如下方法制備:取配方量的甘氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、 苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸，然后溶解在配方量的蒸餾水 中，得到氨基酸溶液。
[0024]實施例2:用于培養病毒的無血清培養液。
[0025] -種用于培養病毒的無血清培養液，所述的用于培養病毒的無血清培養液，包括 DMEM培養基，其特征在于還包括如下組分及其濃度:胰島素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、 微量元素lmg/L、酵母提取物1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纖連蛋白lmg/mL、輔酶R0.5mg/L 、煙酸lmg/L和維生素Clmg/L。
[0026] 其中，所述氨基酸溶液由以下重量份數的組分組成:甘氨酸0.5份、異亮氨酸1份、 絲氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、纈氨酸1份、脯氨酸0.2份、半胱氨 酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5份、蘇氨 酸〇.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、賴氨酸0.6份、精氨酸0.3份、組氨酸0.3份和蒸餾水8 份;所述微量元素由硒〇.2份、銅0.2份、鈷0.2份、鋅0.2份和鎳0.2份組成。
[0027]所述用于培養病毒的無血清培養液的制備方法，包括以下步驟:取配方量的DMEM培養基溶于l〇〇〇ml蒸餾水，加入所述胰島素、牛