一種高效表達人促卵泡激素的cho細胞的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效表達人促卵泡激素的CHO細胞的培養方法，屬于生物制藥技術領域。
【背景技術】
[0002]人促卵泡激素(humanfollicle stimulating hormone，hFSH)是垂體前葉嗜喊性細胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，屬于異二聚體糖蛋白家族，由獨立的基因分別編碼的兩條非共價連接的α鏈和β鏈組成。FSHa鏈的兩個潛在的天冬氨酰胺連接的糖基化位點，分別在52和78的位置，而β鏈的兩個潛在的天冬氨酰胺連接的糖基化位點則分別在7和24的位置(Oli jve ff, de Boer ff ,Mulders JW等(1996)Molecular b1logy andb1chemistry of human recombinant follicle stimulating hormone(Puregon).Mol.Hum.Reprod.2(5): 371-382)。對于女性來說，其主要功能是卵巢細胞和雌激素生成必需的一種生長因子、促分泌劑和細胞生長調節劑，在促使卵泡正常生長、成熟和性腺留體類固醇的產生中不可缺少;對于男性來說，其主要功能是與黃體生成素(LH)控制的睪丸素結合，從而激活和保持正常精子的數目和質量。
[0003]最初醫學使用的促卵泡激素是從絕經期婦女的尿液中提純的，1961年Borth第一次將提取的人促卵泡激素用于人體實驗，取得了較好效果。但是這種提純的促卵泡激素內有黃體生成素和其它人源蛋白的污染，不僅批次間產品會出現糖基結構的差異，而且對尿源的需求量巨大，很難滿足快速增長的市場需求。隨著分子生物學的快速發展，應用重組DNA技術生產的重組人促卵泡激素應運而生，與尿源促卵泡激素(uFSH)相比，rhFSH純度更高，而且沒有其他人源蛋白污染，批間純度一致性更高。雖然二者在臨床療效上沒有明顯差另Ij，但rhFSH在提高安全性和降低副反應方面更具優勢。
[0004]現已上市的商品化重組FSH都是通過中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovarycell，CH0)基因組中插入人FSH表達基因而構建的永久性表達細胞系所生產。最初，重組人FSH都采用含有血清的培養基進行轉瓶或者微載體紙片貼壁培養(Recombinant folliclestimulating hormone: development of the first b1technology product for thetreatment of infertility.Recombinant Human FSH Product Development Group.humReprod Update.1998,4(6): 862-881)，由于其中使用動物來源的血清，既不利于純化，也有潛在的動物病毒感染的風險。可是，在培養基中不添加血清的話，重組FSH的表達量將會顯著降低。近年來也有關于大規模懸浮培養工藝研究的報道(CH0細胞表達rhFSH的大規模無血清培養工藝的研究，吉林大學，2012)，但該工藝種子復蘇采用轉瓶培養，需要轉瓶機，沒有搖瓶培養方便，而且表達量也不高。
【發明內容】
[0005]為解決上述問題，本發明提供了一種采用含有人FSH基因的重組CHO細胞來克服現有的培養方法所致的人FSH表達量低的問題的方法。所采取的技術方案如下:
[0006]本發明的目的在于提供一種高效表達人促卵泡激素的CH0細胞的培養方法，該培養方法是將種子細胞配制成細胞懸液，在利用無血清基礎培養基重懸后進行傳代培養，獲得種子懸液，再將所得的種子懸液接種到生物反應器中進行培養，培養過程中定期流加無血清補料培養基，并監測細胞生長情況并補充葡萄糖溶液，培養結束后收獲細胞。
[0007]所述培養方法的步驟如下:
[0008]1)將重組CH0細胞復蘇活化后，利用無血清基礎培養基重懸后獲得種子細胞溶液；
[0009]2)利用無血清基礎培養基傳代培養步驟1)所得的種子細胞，培養結束后獲得細胞懸液；
[0010]3)將步驟2)所得的細胞懸液接種到生物反應器中進行培養，培養過程中定期流加無血清補料培養基，控制溫度，檢測細胞生長情況，并補充葡萄糖溶液；
[0011]4)培養結束后收獲細胞。
[0012]優選地，所述無血清基礎培養基，由濃度為15-20g/L的⑶-CH0培養基、濃度為16?20g/L的CD Opti CH0培養基、濃度為2?5g/L的SFM4CH0培養基、濃度為17-19g/L的CDM4mab培養基或濃度為16_21g/L的Ex-cell 302培養基中的一種或幾種組成;添加物由濃度為0.1?0.3mM的甲硫氨酸、0.2?0.4g/L的碳酸氫鈉、0.5?2g/L的F68、3?5g/L的D-葡萄糖或1?2g/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸中的一種或幾種組成，pH6.8-7.4，滲透壓280-380m0smol.kg—1。
[0013]更優選地，所述無血清基礎培養基，是濃度為17?19g/L的CD-CH0培養基、16?18g/L CD Opti CH0培養基或3?4g/L的SFM4CH0培養基中的一種或幾種;添加物為0.15?0.25mM的甲硫氨酸、0.28?0.35g/L的碳酸氫鈉、0.8?1.2g/L的F68或2?4g/L的D-葡萄糖中的一種或幾種4耵.0-7.2，滲透壓300-3601110811101.kg—1。
[0014]優選地，所述無血清補料培養基，由濃度為38?45g/L的FeedB培養基，6?12g/L的Cell Boost 5，10?15g/L CM1027或18?22g/L Feed C培養基中的一種或幾種組成；添加物由濃度10?15g/L的D-葡萄糖，1?3mM的甲硫氨酸，8?10g/L的D-半乳糖或8?10g/L的N-乙酰葡萄糖胺中的一種或者幾種組成，pH6.8-7.4，滲透壓600-1200m0smol.kg—1。
[0015]更優選地，所述無血清補料培養基，由濃度為40?42g/L的FeedB培養基，19?21g/L Feed C培養基或8?10g/L的Cell Boost 5中的一種或者幾種組成;添加物由濃度為1.5?2.5mM的甲硫氨酸或8?10g/L的D-葡萄糖組成，pH7.0-7.2，滲透壓800-1000m0smol.kg-1。
[0016]優選地，步驟3)所述生物反應器中進行培養，條件為轉速130-200rpm，溶氧30-80 %，pH6.8-7.4，初始培養溫度為36_38°C ；所述控制溫度，是在培養5_7d后將溫度調整至32-35°(3;培養過程中細胞活率為60-100%。
[0017]更優選地，所述生物反應器中進行培養，條件為轉速150-180rpm，溶氧40-60%，PH7.0-7.2，初始培養溫度為36.6_37°C ；所述控制溫度，是在培養5_7d后將溫度調整至33-34°C，培養過程中細胞活率為80-100 %。
[0018]優選地，步驟3)所述定期流加無血清補充培養基，是在發酵后第2-9天流加，流加次數為2-5次，流加比例為8-15%。
[0019]更優選地，所述定期流加無血清補料培養基，是在發酵后第3-8天流加，流加次數為3-4次，流加比例為10-12%。
[0020]優選地，步驟3)所述補充葡萄糖溶液，是使培養液中葡萄糖濃度在l-8g/L。[0021 ]所述的方法的具體步驟如下:
[0022]1.將低溫保存的重組CHO細胞取出后在37°C水浴融化后離心留取沉淀，再利用無血清基礎培養基重懸，獲得種子細胞溶液；
[0023]2.利用無血清基礎培養基傳代培養步驟I)所得的種子細胞，培養條件為:轉速120rpm，溫度37°C，濕度75%，⑶2濃度5%，培養7天經過4級傳代培養后獲得細胞懸液；
[0024]步驟I)和步驟2)所用無血清基礎培養基是由18g/L CD-CHO培養基、3.5g/LSFM4CH0培養基、0.2mM的甲硫氨酸、0.3g/L的碳酸氫鈉和1.0g/L的F68組成，pH7.2，滲透壓340m0smol.kg-1 ；
[0025]3.將步驟2)所得的細胞懸液接種到生物反應中進行培養，反應器體積為3L，接種細胞密度為5 X 15個/mL，初始培養條件為:轉速150rpm，溶氧40 %，溫度37°C，pH值7.2，在培養的第4，6和8天分別補充10%的無血清補充培養基，培養的第7天將溫度調節為33°C;培養過程中檢測細胞生長情況，并補充葡萄糖溶液使培養液中葡萄糖含量不低于lg/mL;所用無血清補料培