一種用于糞便中艱難梭菌分離培養的試劑的使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于糞便中艱難梭菌分離培養方法領域，具體涉及用于糞便中艱難梭菌分 離培養的試劑與使用方法。
【背景技術】
[0002] 艱難梭菌(Clostridiumdifficile，CD)又名難辨梭菌或難辨梭狀芽孢桿菌，是一 種具有芽胞結構的革蘭氏陽性嚴格厭氧桿菌，是全球范圍內公認的醫院內感染與抗生素性 腹瀉最為重要的病原微生物。它能夠引起抗生素相關性腹瀉、結腸炎、致死性偽膜性腸炎 等。2013年，艱難梭菌被美國國家衛生部列為抗生素相關耐藥菌三大病原菌之首，威脅程度 指定為〃最緊急〃。2015年2月份發表在《新英格蘭醫學雜志》的最新文章《美國艱難梭菌感染 的負擔》顯示，在美國每年感染患者超過50萬人，死亡人數超過2.9萬，平均病死率為5.5-6.9%，重癥死亡率在60%以上，每年用于治療的醫療費用在100億美金以上。在中國，抗生 素濫用和嚴重，據最新報道艱難梭菌感染占院內腹瀉中患者人數25%以上，抗生素相關腹 瀉中20-30%;腫瘤放療患者中感染患者在30%以上。艱難梭菌感染易出現抗生素耐藥、反 復復發、傳染性、高致死性;在全球范圍內，艱難梭菌早已成為醫院感染與抗生素耐藥領域 臭名昭著的〃超級臭蟲〃。
[0003]細菌培養是臨床病原微生物診斷的〃金標準〃，是病原微生物研究的重要手段與先 決條件。我國已將艱難梭菌研究納入〃十二五〃國家傳染病重大科技專項，由于培養分離條 件嚴格苛刻，相關研究報道仍然較少。在臨床實踐中，艱難梭菌較難培養，究其原因主要包 括兩點：（1)艱難梭菌培養條件較為苛刻，需要嚴格厭氧條件；（2)糞便中存在大量雜菌，影 響艱難梭菌培養;該點原因為目前艱難梭菌培養不理想的主因。
【發明內容】
[0004]本發明提供一種用于糞便中艱難梭菌分離培養的試劑、該試劑在艱難梭菌分離培 養鑒定等中的應用以及該試劑的具體使用方法，通過上述試劑以及使用方法，可以抑制糞 便中雜菌，并提高艱難梭菌陽性培養率，保證鑒定結果的準確。
[0005]本發明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0006]本發明提供一種用于糞便中艱難梭菌分離培養的試劑的使用方法，所述試劑為硫 磺膽酸鈉的酒精溶液，在使用時，包括以下步驟：
[0007] 1)在糞便中加入硫磺膽酸鈉的酒精溶液，混合均勻，得到混合體系；
[0008] 2)將混合體系靜置；
[0009] 3)將步驟2)靜置后的混合體系離心，去除懸浮顆粒；
[0010] 4)取上清，接種到艱難梭菌選擇培養基，厭氧條件下培養；
[0011] 5)挑選表面粗糙、邊緣不齊并產特殊氣味的黃色菌落，進行革蘭氏染色;革蘭氏染 色呈陽性并且有明顯火柴頭狀芽孢的菌落判定為陽性，即為艱難梭菌;否則判定為陰性，即 不是艱難梭菌。
[0012] 采用上述方案的有益效果是：
[0013] 該方法步驟設置合理，利用合適的試劑以及培養條件抑制糞便中雜菌，并提高艱 難梭菌陽性培養率，保證鑒定結果的準確。
[0014] 本發明所述的方法具有操作簡單、所需時間短、鑒定結果的準確率高、培養簡易、 陽性率高、污染少等優點，具有廣闊的應用前景，尤其適用于醫院、科研單位艱難梭菌分離 培養推廣應用。
[0015] 進一步，步驟1)中，酒精占混合體系的體積百分比為75%，硫磺膽酸鈉占混合體系 的質量百分比為0.1%。
[0016] 采用上述進一步方案的有益效果是：質量百分比為0.1 %的硫酸膽酸鈉促進艱難 梭菌芽孢生成，體積百分比為75%的酒精能夠殺滅糞便樣本中的雜菌，而對艱難梭菌芽孢 沒有影響；同時混合質量百分比為0.1%的硫酸膽酸鈉與體積百分比為75%的酒精可以增 強艱難梭菌芽孢生成，并且縮短處理時間。
[0017] 酒精濃度過高或過低不利于殺滅糞便樣本中的雜菌;而硫磺膽酸鈉濃度過高或過 低不利于艱難梭菌的芽孢形成與芽孢保護。
[0018] 進一步，步驟2)中，靜置的時間為1小時。
[0019]采用上述進一步方案的有益效果是:充分保證艱難梭菌芽孢生成與殺滅糞便中的 雜菌，并且不犧牲工作人員的工作效率。
[0020] 進一步，步驟4)中，所述艱難梭菌選擇培養基為CCFA選擇培養基。
[0021] 采用上述進一步方案的有益效果是:為艱難梭菌的常用選擇培養基，有利于艱難 梭菌的生長，同時避免其他雜菌的過度生長。
[0022]進一步，步驟4)中，厭氧條件下培養條件為：30_37°C厭氧培養箱或厭氧袋培養 24h-48h〇
[0023] 采用上述進一步方案的有益效果是:為艱難梭菌的常用選擇培養基，有利于艱難 梭菌的生長。
[0024] 進一步，步驟5)之后，再進行以下步驟:將挑選判定為陽性的菌株通過PCR擴增保 守基因進行鑒定。
[0025] 采用上述進一步方案的有益效果是:本發明所述的方法在初步鑒定后，可以與PCR 鑒定相結合，進一步鑒定結果的準確性。
[0026] 在研究的過程中，發明人意外的發現，硫磺膽酸鈉和酒精一起配合使用，可以用于 糞便中艱難梭菌分離培養，可以抑制糞便中雜菌，并提高艱難梭菌陽性培養率，保證艱難梭 菌的鑒定結果的準確，并具有配制簡單、快速、簡便和準確率高等優點。在具體操作的過程 中，將糞便與硫磺膽酸鈉的酒精溶液混在一起，酒精占總體系的體積百分比為50%_80%， 硫磺膽酸鈉占總體系的質量百分比為〇. 05%-0.5%。
【附圖說明】
[0027] 圖1是根據本發明的實施例1，從25例艱難梭菌患者糞便中菌培養的結果，陽性對 照為實施例2中PCR法檢測糞便艱難梭菌結果，方法1為本發明提供方法，方法1為本發明提 供方法;方法2為單純酒精處理法;方法3為傳統方法。
【具體實施方式】
[0028]以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并 非用于限定本發明的范圍。
[0029]實施例1艱難梭菌分離與培養[0030] 1、實驗材料
[0031]硫磺膽酸鈉購自湖北盛天恒創生物科技有限公司，艱難梭菌基礎培養基、頭孢西 丁溶液、50%卵黃鹽水懸液、D-環絲氨酸溶液均購自招遠拓撲生物工程公司，厭氧培養箱 (美國科路森），便基因組DNA提取試劑盒DP328-02購自天根生化科技（北京）有限公司，弓丨 物、探針均購自Invirogen公司，10XPCR buffer、HS Taq、dNTP購自Takara公司。
[0032] 2、糞便樣本收集
[0033]收集2014年11月到2015年3月醫院期間腹瀉患者糞便樣本(包括水樣便、稀便、果 凍樣便等)25例，所選患年齡均為18歲以上，具有一周以上抗生素、免疫抑制劑或化療藥物 使用；采集患者糞便標本l_2mL，如果不及時處理，標本保存于10%的甘油肉湯EP管中，-20 °C保存。
[0034] 3、溶液、培養基配制
[0035] (1) 1%硫磺膽酸鈉配制
[0036]稱取lg硫磺膽酸鈉，溶解于100mL雙蒸水中，充分溶解后，分裝密封儲存。
[0037] (2)艱難梭菌CCFA選擇培養基配制
[0038]按照培養基配制說明書，稱取1lg艱難梭菌基礎培養基，加入200mL雙蒸水，12