一種具有緩解pfoa毒害功能的植物乳桿菌及其應用
【專利說明】一種具有緩解PFOA毒害功能的植物乳桿菌及其應用 【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物技術領域。更具體地，本發明涉及一種具有緩解PF0A毒害功能 的植物乳桿菌及其應用，本發明還涉及所述植物乳桿菌的用途。 【【背景技術】】
[0002] 全氟辛酸(Perfluorooctanoate，PFOA)是當今世界上最受關注的一種全氟類有機 酸，其自身具有優良的化學穩定性、熱穩定性，還具有較高的疏水疏油的特性，在碳氧化合 物極低的情況下能在其表面使氟化物具有極高的表面活性，是合成聚四氟乙烯化工產品的 重要原料，被人們普遍大量的用于工業生產和使用的生活消費品中。由于具有穩定的化學 性質，PF0A在環境中很難被降解，從而造成其在環境中長期穩定地存在，而一旦進入生物 體，這些化合物就很難被排出體外或者被分解。研究表明，PF0A在人體內的半衰期為3.8年。 其進入生物體內，不易在脂肪中富集，而是更易與蛋白結合存在于血液、肝臟等組織器官 中。與此同時，PF0A的高穩定性使得其在生物體內不斷積累，具有生物富集性以及沿食物鏈 的生物放大效應。其所造成的環境問題己遍布全球各處，重多研宄人員將其視為持久性有 機污染物家族的新成員而對其進行更為深入且全面的研究。毒理學研究發現PF0A具有肝臟 毒性、免疫毒性、生殖毒性、胚胎發育毒性、致癌性等。肝臟作為動物個體生命活動中的重要 器官，其擔負機體主要代謝和解毒功能，同時肝臟也是PF0A的主要靶器官之一，也是PF0A引 起毒性的一個重要作用部位。2005年，美國環保局科學顧問委員會根據有關的毒理學數據， 提議PF0A為一種"可疑致癌物質"。
[0003] 考慮到PF0A對生態環境和人類健康的潛在威脅，包括美國杜邦公司和瑞士汽巴公 司等知名化工企業在內的所有8家仍在使用PF0A的公司也已同意最遲于2015年停止生產或 使用PF0A。發達國家對于PF0A的生產和使用的禁令也正在醞釀之中。我國PF0A的生產和使 用情況則不容樂觀。中國氟硅有機材料協會的梅勝放指出，我國專門生產PF0A的企業至少 有2家，另有約8家企業生產氟聚合物，全都使用PF0A作為乳化劑，每年的使用量約為100噸。 PF0A類化合物在全球環境介質中的廣泛存在，可以通過飲食、呼吸等途徑進入到人體和生 物體內，對人體和生物體造成傷害。作為一種新興污染物，PF0A的相關研究尚處在起步階 段，目前研究主要集中在環境介質中污染狀況的調查分析及毒性研究，關于PF0A的治理研 究主要集中在吸附和降解2種方式。而對于由PF0A中毒引起的各種生理病癥，目前主要研究 其毒性機理，尚沒有開發有效的藥物來治療其帶來的毒性損傷。但是PF0A的蓄積毒性和中 毒癥狀引起了越來越多的關注，因此尋找一種新的干預或治療方法顯得十分必要。
[0004] 乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發酵并產生乳酸的細菌的統稱，廣泛存在于自然 發酵乳制品、發酵植物食品，如泡菜、酸菜、青貯飼料以及人腸道中。長期科學研究結果表 明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生 理功能有:防治乳糖不耐癥、恢復人體腸道內菌群平衡維護人體健康、抗腫瘤和預防癌癥作 用、控制人體內毒素水平、抗氧化作用、保護肝臟并增強肝臟的解毒等功能。乳酸菌作為一 種食品級的微生物，不像螯合劑有嚴重的毒副作用，且已有諸多報道表明其在體外、體內對 重金屬等污染物具有較好的吸附作用，很有潛力成為具有吸附PFOA，保護機體避免PFOA造 成損傷的新型保健食品。因此，篩選出一種對PF0A具備優良耐受和吸附能力以及具有強抗 氧化能力的乳酸菌，并且證明它們在動物模型中具有良好的緩解PF0A毒性損傷作用，同時 研制這些乳酸菌實際的用途就顯得十分必要。本發明試圖進一步地挖掘益生菌的功能，開 發具有更高保健價值的乳酸菌，為利用膳食策略緩解由PF0A導致的中毒效應開辟出新的途 徑和解決方案。 【
【發明內容】
】
[0005]本發明的目的是提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM738。
[0006]本發明是通過下述技術方案實現的。
[0007]本發明涉及一種乳酸菌，利用形態特征、培養性狀和生理生化特征等微生物學特 性對該乳酸菌鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM738，該菌株已于2015年 10月8日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 11471。
[0008] 所述的植物乳桿菌CCFM738具有下述性質：
[0009]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環境條件下生長良好，在pH2.5環境下存活良好；
[0010]⑵在體外含有PF0A的培養基中培養，對PF0A有良好的耐受能力；
[0011]⑶在體外含有PF0A的水溶液中孵育，對PF0A有良好的吸附能力；
[0012]⑷具有緩解PF0A暴露小鼠中毒癥狀，改善PF0A暴露小鼠肝損傷程度的作用。
[0013]所述的植物乳桿菌CCFM738在制備緩解PF0A中毒的藥物組合物與/或發酵劑中的 應用也屬于本發明要求保護的范圍。
[0014] 根據本發明的一種優選實施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM738菌 劑與在藥學上可接受的載體組成的。根據本發明的另一種優選實施方式，所述的植物乳桿 菌CCFM738菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM738的菌液通過常規冷凍干燥工藝制備或其 它方法制備所得到的粉劑，它含有1 〇6CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM738。
[0015]根據本發明的另一種優選實施方式，在藥學上可接受的載體是一種或多種選自在 藥學上通常使用的填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑或矯味劑的載體。
[0016]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液劑型。
[0017]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵劑是通過下述制備步驟得到的：
[0018] A、培養基的制備：使用以所述培養基總重量計87.7 %水將10 %酶水解脫脂乳、 0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨與0.3%酵母浸膏溶解，然后調整其pH為6.8,這樣得到所述的 培養基；
[0019] B、保護劑的制備:使用水與保護劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/ L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸鈉的保護劑；
[0020]C、將植物乳桿菌CCFM738菌種按照以所述培養基的重量計2-4%接種量接種到在 溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養基中，在溫度37°C下培養18h，用pH7.2磷酸鹽緩 沖液清洗2-4次，用所述保護劑重懸達到濃度101()CFU/ml;接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預 培養60min，再進行冷凍干燥得到所述的發酵劑。
[0021 ]下面將更詳細地描述本發明。
[0022] 本發明涉及一種植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)CCFM738，該菌株已于 2015年10月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類學命名為植 物乳桿菌Lactobacillusplantarum，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編 號為CGMCCNo.11471。
[0023] 本發明人根據下述篩選標準，通過大量篩選實驗與分析驗證，從我國傳統食品，例 如泡菜，發酵奶酒中篩選出的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM738具有下述性 質：
[0024]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環境條件下生長良好，在pH2.5環境下存活良好；
[0025]⑵在體外含有PF0A的培養基中培養，對PF0A有較好的耐受能力；
[0026]⑶在體外含有PF0A的水溶液中孵育，對PF0A有良好的吸附能力；
[0027]⑷具有緩解PF0A暴露小鼠中毒癥狀，改善PF0A暴露小鼠肝損傷程度的作用。
[0028]下面將詳細描述這些實驗與分析認證結果。
[0029] 1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0環境條件下生長良好，在pH2.5環境下存活良好
[0030]將冷凍保存的本發明植物乳桿菌CCFM738接種于MRS培養基(例如青島海博生物技 術有限公司的產品）中，在溫度37°C下培養18h，再經MRS培養液傳代培養2~3次后，以1 %的 接種量分別接種于不同pH值(3.0-9.0)的MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養18h，測定初 始和培養結束后的〇D6QQ值，利用這個值測量在細菌培養液中的細胞濃度，從而估計細菌的 生長情況。OD600值是采用分光光度法在波長600nm處測定的細菌培養液的吸光值，它通常用 于表示在細菌培養液中細胞濃度，以確定液體培養物中細菌的生長情況。
[0031] 試驗結果證明植物乳桿菌CCFM738在PH3.0-9.0的環境中生長良好，因此得以進行 后續實驗。采用與前面所述的同樣培養方式，用l.OmLpH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗菌體 兩次，再用l.OmLpH7.2磷酸鹽緩沖液重懸，其重懸乳桿菌菌體與9.OmLpH2.5人工胃液混 合，然后在溫度37°C下進行培養，分別在開始(Oh)和3h時取樣，用MRS瓊脂培養基澆注培養 進行平板菌落計數，測定活菌數并計算其存活率。存活率是在該培養液中在第3h時的活菌 數對數值與在第〇h時活菌數對數值之比，以％表示。本發明篩選存活率在80 %以上的菌株 進行后續研究。
[0032] 實驗結果表明，植物乳桿菌CCFM738在pH2.5的人工胃液環境中的存活率在90%以 上。由此可見，植物乳桿菌CCFM738具有耐酸性，在pH2.5的環境下存活良好。
[0033] 2、在體外含PF0A的培養基中培養，對PF0A具有良好的耐受能力 [0034] 植物乳桿菌CCFM738對PF0A耐受能力通過最低抑制濃度（MIC)方法測定。配制 100mg/L的PF0A溶液作為PF0A的母液，并用孔徑大小為0.22μπι的無菌過濾器進行過濾。將除 菌