[0055] ITS序列PCR擴增體系如表1所示:表1.
[0057] 注:表1中的Template DNA為上述制成DNA模板。
[0058]PCR反應條件如表2所示：
[0059]表2.
[0062] 注:表2中步驟2進行30個循環。
[0063]PCR擴增產物的電泳檢測：
[0064]電泳條件為1%的瓊脂糖凝膠(含Goldview5μl/100ml)，lXTBE電泳緩沖液，90V電壓電泳1小時，PCR產物上樣量為3yL，與lyLLoadingdye混勻后點樣。在254nm紫外下觀 察結果，以TaKaRa公司的DL1000DNAMarker為核酸標準分子量參照物，確定擴增片段長度。 擴增產物帶應在標準物400-700bp的位置上。
[0065]PCR產物純化和測序：由深圳華大基因科技有限公司進行。
[0066 ]系統進化樹的構建：
[0067] 將所測的ITS序列與GenBank基因庫中已測定的真菌的ITS序列進行比對，根據比 對結果下載相關序列。通過MEGA6.0的鄰接算法(Neighbor-joiningNJ)進行系統分析并 構建系統進化樹，如圖3所示。
[0068] 結果：
[0069](一）菌株形態特征
[0070] 菌落大小：在人工PDA培養基上比商品化的TOA培養基上生長好，在人工PDA上，菌 落局限生長，生長緩慢，培養一個月，菌落紡錘狀，直徑20mm，高度5mm;
[0071 ]菌落顏色:菌落正面深灰綠，反面中心黃綠，邊緣深綠，培養基略紅；
[0072] 菌落的組織形狀:新菌絲組成緊密的地毯狀，老菌絲絨毛狀，菌落邊緣波狀，；
[0073] 菌落的表面形狀:新菌絲緊密，老菌絲絨毛狀，菌落表面有水滴；
[0074] 菌絲:基質菌絲墨綠，氣生菌絲深灰綠，無孢子。老菌絲灰白，新菌絲灰綠。
[0075] 孢子形態特征:經誘導，無孢子。
[0076](二)菌株ITS序列及其系統發育學分析
[0077] 利用引物ITS1和ITS4,從菌株基因組DNA中擴增出一條500-600bp大小的片段，經 測序并將測序結果通過GenBank中BLASTn比對，根據比對結果下載相關的參考菌株序列，利 用MEGA6的鄰接算法(Neighbor-joiningNJ)進行系統分析并構建系統進化樹。結果表明， 菌株了1^(￥-59-2與1?1161〇。61'。〇8口〇1^(1;[111118口.02；1^14化1]543257)聚在一起形成支持強度為 99%的末端分支。堿基相似性比較結果表明，11^(￥-59-2與1?1161〇〇61'(3〇8。〇1^(1;[111118。.02；1^14 (EU543257)沒有差異，序列相似性為100 %。綜合形態學和分子生物學特征，將菌株初步鑒 定為Rhexocercosporidiumsp.0
[0078] 實施例2
[0079] 菌株的代謝產物對三七黑斑病菌的抑制作用
[0080] -、菌的發酵培養和發酵產物的提取
[0081 ] (1)將越南槐內生真菌TRXY-59-2接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平面皿(PDA平 板）中，置于溫度為28°C下培養20天，所得培養材料切成塊狀并轉移到無菌固體培養基(含 400g馬鈴薯、20g的右旋糖和20g蔗糖）的2升的錐形瓶中，置于28°C條件下發酵60天；
[0082] (2)發酵完成后，用發酵物2倍的甲醇浸泡發酵物并超聲40min，然后用紗布過濾， 取濾液；
[0083] (3)重復步驟（2)兩次，合并兩次濾液進行減壓濃縮成浸膏，得到內生真菌TRXY- 59-2發酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內生真菌TRXY-59-2代謝產物。
[0084]二、越南槐內生真菌TRXY-59-2代謝產物對三七黑斑病菌的菌絲生長的抑制作用[0085]用菌絲生長法測定菌株TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌菌絲生長的抑制活 性。將菌株TRXY-59-2的代謝產物和多菌靈粉劑（陽性對照）分別制成含2mg/mL，4mg/mL， 8mg/mL濃度代謝產物的含藥平板。在無菌條件下，用打孔器將三七黑斑病菌制成6mm菌餅， 把三七黑斑病菌菌餅接到各含藥平板中央為處理，以不含藥平板中央接的三七黑斑病菌菌 餅為陰性對照，所有處理和對照重復三次，所有平板置于28°C培養。藥物濃度按多菌靈粉劑 的田間應用濃度設置。待陰性對照長滿培養皿時，分別測量對照菌落和處理菌落的生長直 徑，并根據以下公式，計算抑制率：
[0086]陰性對照生長量=陰性對照生長直徑-菌餅直徑[0087]處理生長量=處理生長直徑-菌餅直徑
[0089] 三、越南槐內生真菌TRXY-59-2代謝產物對三七黑斑病菌的最小抑菌濃度 [0090]用肉湯稀釋法測定菌株TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌的最小抑菌濃度。 將在PDA培養基中培養5天的三七黑斑病菌菌餅接種于含0.2%吐溫80(v/v)的液體培養 基中，28°C，150r/min搖床培養7天，然后將培養物轉到三角瓶，并倒入含0.2 %吐溫80的無 菌雙蒸水，用磁性棒攪拌30min，將溶液用無菌紗布過濾，得到孢子溶液，并用血球計數板將 孢子濃度調節到每毫升1〇4個孢子備用。將菌株TRXY-59-2的代謝產物用1%DMS0溶解成 80mg/mL的代謝產物處理濃度，取5支無菌試管依次排列在試管架上，分別編號為1、2、3、4、 5,每管分別加入lml含0.2%吐溫80的無菌雙蒸水，然后將lml80mg/mL的菌株甲醇粗提物 溶液加入編號為1的試管中并依次在各管中進行兩倍連續稀釋，并將lml上述所得孢子溶液 (104個/ml)分別加入各管中，從而獲得最終的代謝產物處理濃度：20mg/ml(編號1試管）， 10mg/ml(編號2試管），5mg/ml(編號3試管），2 · 5mg/ml(編號4試管），1 · 25mg/ml(編號5試 管hlml的1%DMS0和lml的8mg/mL氟硅唑乳油分別代替代謝產物執行上述處理過程而作為 陰性對照和陽性對照，所有處理和對照重復三次。最后，各管2 8 °C，15 0r/miη搖床培養5天。 TRXY-59-2的代謝產物的MIC值為完全抑制三七黑斑病菌可見生長的最小粗提物濃度。
[0091]結果：
[0092]菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌菌絲生長的百分抑制 率如表3中所示：
[0093]表3.
[0094]
[0095]注:表中陽性對照多菌靈粉劑含50%多菌靈;表中*表示數據通過單因素方差分析 的LSD比較后，菌株TRXY-59-2的代謝產物和陽性對照多菌靈粉劑在相同濃度下，在PQ.〇5水 平上具顯著性差異。
[0096]菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌菌絲生長的抑制結果 表明，菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌的菌絲生長均具有非常 好的抑制效果，從表3可以看出TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌A.panax菌絲生長的 百分抑制率為99.03-100.00%，與陽性對照多菌靈粉劑比較，菌株TRXY-59-2的代謝產物對 三七黑斑病菌A.panax菌絲生長的抑制效果比對照好。
[0097] 菌株TRXY-59-2代謝產物對三七黑斑病菌生長的最小抑菌濃度如表4所示：
[0098]表4.
[0?00] 注:表中陽性對照氟娃唑乳油有效成分含量為400mg/mL。
[0101] 菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌生長的最小抑菌濃度 測試結果表明，菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌均具有較強的 抑制作用，從表4可以看出越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物對三七黑斑病菌A.panax 的最小抑菌濃度為1.25mg/ml，是陽性對照的5倍。
[0102] 從表3和表4可知，菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物中含有很強的抑真 菌或殺真菌的成分，因此，在三七黑斑病菌的生態防治上，菌株越南槐內生真菌TRXY-59-2 具有突出的潛力。
[0103]前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變 和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應 用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。
[0104]
【主權項】
1. 一種越南槐內生真菌TRXY-59-2，其特征在于:越南槐內生真菌TRXY-59-2的分類命 名為Rhexocercosporidiumsp.TRXY-59-2,保藏號：CGMCCNo.10109。2. -種如權利要求1所述的越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物的制備方法，其特征 在于，操作步驟如下： (1) 將越南槐內生真菌TRXY-59-2接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平面皿中，置于溫度 為28°C下培養20天，所得培養材料切成塊狀并轉移到無菌固體培養基中，置于28°C發酵60 天； (2) 發酵完成后，用發酵物2倍的甲醇浸泡發酵物并超聲40min，然后過濾； (3) 重復步驟(2)兩次，合并兩次濾液進行減壓濃縮成浸膏，得到內生真菌TRXY-59-2發 酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內生真菌TRXY-59-2代謝產物。3. 根據權利要求2所述代謝產物的制備方法，其特征在于：步驟（1)中所述的無菌固體 培養基含400g馬鈴薯，20g的右旋糖和20g蔗糖。4. 一種如權利要求2制備所得越南槐內生真菌TRXY-59-2的代謝產物在防治三七黑斑 病中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種越南槐內生真菌TRXY-59-2，越南槐內生真菌TRXY-59-2的分類命名為Rhexocercosporidium？sp.TRXY-59-2，菌株的ITS序列如SEQ？ID？NO.1所述，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2014年12月03日，保藏號：CGMCC？No.10109。本發明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內生真菌(Rhexocercosporidium？sp.)TRXY-59-2，該菌對三七黑斑病菌具有很強的抑制作用，為三七真菌病害的生物防治領域帶來廣闊的應用前景。CGMCC No. 1010920141203
【IPC分類】C12P1/02, A01N63/04, C12R1/645, C12N1/14, A01P3/00
【公開號】CN105462848
【申請號】CN201510979105
【發明人】姚裕群, 黃榮韶, 吳炫柯, 李良波
【申請人】廣西大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月23日