一種篩選用于促進植物吸收重金屬的根系共生菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境保護技術領域，具體涉及一種篩選用于促進植物吸收重金屬的根系共生菌的方法。
【背景技術】
[0002]隨著工業的發展，水污染、土壤污染、大氣污染日趨嚴重，其中，由于采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬超標制品等人為因素所導致的重金屬污染難以處理，對人體健康造成了較為嚴重的危害。
[0003]重金屬與有機物污染不同，很難被微生物降解，修復重金屬污染土壤的途徑之一是通過超富集植物吸附吸收。但由于植物根系環境中的微生物、根系、土壤酶、金屬離子之間存在復雜的關系，所以需從植物根系及其周邊環境中篩選出有益根際微生物。一方面，有益根際微生物會促進植物的生長、有助于提高植物的修復效率。如科學家把從污染土壤中分離的菌根菌接種到超富集植物蜈蚣草中，發現菌根菌的接種顯著增加了植物對As的吸收和植物中的As含量。另一方面，有益根際微生物還具有對重金屬毒性的抗性，能更好地適應重金屬污染環境，且不會對生態系統造成二次污染。因此，篩選促進重金屬植物修復的根系共生菌是重金屬污染土壤修復技術的一個重要領域。
[0004]目前，傳統的篩選方法是采用液體搖瓶培養法篩選，這種方法存在的主要缺點是僅能篩選到在懸浮液體中快速生長的微生物，而具有吸附特性的根際有益菌很難被篩選到。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種篩選促進重金屬土壤植物修復的根系共生菌的方法，用于解決重金屬土壤的修復問題。
[0006]本發明要求保護的技術方案如下:
[0007]篩選用于促進植物吸收重金屬的根系共生菌的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008](1)獲取樣品:以在重金屬污染嚴重的土壤中生長良好的植物樣品的完整根系以及根系周圍的土壤為樣品；
[0009](2)菌體富集:將采集的樣品剪碎后加入富集瓶中，所述富集瓶盛裝有含有固相吸附載體、重金屬化合物和制霉菌素的液體培養基，所述固相吸附載體用于吸附根系所帶的細菌；
[0010](3)菌種初篩:搖床培養所述富集瓶，將經搖床培養后的富集瓶中的固相吸附載體取出，置于含有重金屬化合物的無菌固體培養基上，長出單菌落后，分離單菌落，單獨培養獲得單菌落菌液。
[0011](4)菌種復篩:將所述單菌落菌液和重金屬化合物加入到水培植物的根部培養液中共培養，檢測水培植物體內的重金屬含量，比對照的重金屬含量高的處理所對應加入的單菌落菌液即為促進重金屬土壤植物修復的根系共生菌。
[0012]優選地，所述固相吸附載體選用活性炭、稻殼、珍珠巖或玉米秸桿中的一種或多種，使用比例參照:150ml的三角瓶中投入5-20g。
[0013]優選地，所述重金屬化合物選自氯化鋅、硫酸鋅、氯化銅中的一種或多種，其在所述液體培養基、所述固體培養基以及水培植物的根部培養液中的濃度為樣品采集地污染土壤中重金屬濃度的8?12倍。
[OOM]優選地，每100ml所述液體培養基中添加4?6mg所述制霉菌素。
[0015]優選地，所述搖床培養條件為:溫度30°C，轉速150?180r/min，培養30?60天;所述將經搖床培養后的富集瓶中的固相吸附載體取出指培養過程中每5天將富集瓶中50 %的固相吸附載體轉移到新的所述富集瓶中培養，取出經富集培養的最后一個富集瓶中的固相吸附載體。
[0016]優選地，所述菌種復篩步驟中的共培養條件:30°C，60r/min搖床培養30?60天。
[0017]優選地，所述水培植物為綠蘿或彩葉草。
[0018]優選地，還包括在菌體富集之前對采集的樣品采用無菌水進行初步沖洗。
[0019]優選地，上述方法中，所述液體培養基的配方為:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水 1000ml，pH為7.2 ± 0.2;
[°02°]所述固體培養基的配方為:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂20g，蒸餾水 1000ml，pHS7.2±0.2。
[0021]本發明提供了一種直接、有效篩選促進重金屬土壤植物修復的根際細菌的新方法，該方法能更快更準確地篩選到能夠促進植物對重金屬吸附吸收的有益菌，提高了篩選效率，使篩選出的有益菌接種到植物后對重金屬污染的土壤具有更強的治理能力。
[0022]相比于現有技術，本發明所述的篩選促進重金屬植物修復的根系共生菌的方法具有以下優勢:本發明首先對植物和土壤樣品進行采集和預處理，之后對其進行富集處理，并在富集瓶的制作過程中加入吸附載體、重金屬化合物、營養肉湯和制霉菌素，其中，營養肉湯和制霉菌素是為了供給細菌營養和在富集過程中起到抗霉菌的作用，使得細菌更容易篩選。本發明相對于傳統的方法還在富集過程中添加有吸附載體和重金屬化合物，吸附載體的添加能使易吸附的菌種大部分均吸附在吸附載體上，更接近根系的自然環境模擬，使得更容易篩選到與植物根系共生的優勢菌種，重金屬化合物的添加在富集瓶中使細菌形成了一個偏食的環境，促進細菌吸附重金屬化合物特性的顯現。在富集處理后對得到的固體物質進行初篩和分離。最后，通過富集植物培育直接復篩及驗證，觀測植物生長狀況及檢測植物體內重金屬的含量，篩選到有促進植物對重金屬吸附吸收功能的有益菌。
[0023]在本發明的一些方案中，選用活性炭、稻殼、珍珠巖或玉米秸桿中的一種或多種作為固相吸附載體，使用前粉碎至邊長小于lcm。固相吸附載體的添加能使大部分易吸附的菌種均吸附在吸附載體上，方便后期對固體物質進行處理和對菌種的提取分離，也更易于分離出吸附性強的菌種。將固相吸附載體的邊長粉碎至小于lcm，能夠增大總的吸附面積，提高菌體的吸附效率。
[0024]在本發明的一些方案中，所述液體培養基優選為營養肉湯，其配方為:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000ml，調節pH為7.2±0.2。為細菌的生長提供充分的營養和最佳的酸堿度，使其大量繁殖，避免漏篩數量稀少的細菌。
[0025]在本發明的一些方案中，所述重金屬化合物在液體培養基或固體培養基中的濃度為樣品采集地污染土壤中重金屬濃度的8?12倍，優選為10倍。重金屬化合物的添加給細菌形成了一個偏食環境，促進細菌吸附重金屬化合物特性的顯現。所述重金屬化合物可以是氯化鋅、硫酸鋅、氯化銅中的一種或多種。
[0026]在本發明的一些方案中，每100ml液體培養基中添加4?6mg制霉菌素，在菌體富集過程中抑制霉菌的生長和繁殖。
[0027]在本發明的一些方案中，所述搖床培養條件為:溫度30°C，轉速150?180r/min，培養30?60天;培養過程中每5天將培養瓶中50%的固體物質轉移到新的培養瓶中，即第一個培養瓶在經過5天的搖床培養后，將第一個培養瓶中的固體物質的50%轉移到第二個新的培養瓶中，在第二個培養瓶經過5天的搖床培養后，將第二個富集瓶中的固相吸附載體物質的50%轉移到第三個新的培養瓶中，依次類推，共培養30?60天。取出經菌體富集培養得到的最后一個培養瓶中的固相吸附載體，對其進行菌種初篩。
[0028]在本發明的一些方案中，采用無菌水輕輕沖洗掉固相吸附載體上帶著的土壤顆粒和非吸附性菌體，然后將固相吸附載體置于固體培養基平板上，上下涂抹后置于培養箱中30°C恒溫培養5天。然后將固體培養基平板從培養箱中取出，將固相吸附載體周圍的菌苔刮下，并在上述固體培養基平板上劃線分離出單菌落。將各個單菌落分別接種到營養肉湯中進行搖床培養，30°C，150