的陽離子脂質、轉基因載體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及陽離子脂質以及轉基因載體，具體涉及一種同時含大環多胺[12] aneN3的陽離子脂質、含該類陽離子脂質的轉基因載體及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 基因治療是將外源正常的基因通過一定的方法導入靶細胞，代替或者補償一些缺 陷或者異常的基因以達到治療的目的。基因治療為很多疾病的治療提供了可能性，如：癌 癥、糖尿病、囊胞性纖維癥、艾滋病、心血管疾病等。
[0003] 基因治療的關鍵是是要把治療基因高效地導入細胞內，然而裸露的DNA-般以舒 展的線型螺旋形式存在，體積較大，并且DNA分子本身為帶負電的陰離子，進入細胞時會與 細胞膜外層的陰離子之間產生靜電排斥作用。這些不利因素都使得DNA分子在不借助其它 技術手段的情況下，無法獨立穿過細胞膜，因此發展有效的基因載體是基因治療成功的前 提條件。
[0004] 基因載體包括病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體是一種尚效的轉染試劑，但 是它存在缺點，如免疫原性、致癌性，基因的大小容易受到病毒所容納的大小限制、同時存 在變異的可能性，因此其安全性令人擔憂。病毒載體無免疫原性、便于大規模生產，但轉染 效率低于病毒載體。因此開發低毒高效的非病毒基因載體具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 作為各種廣泛且細致的研究和實驗的結果，本發明的發明人已經發現，在大環多 胺[12]aneN3類陽離子脂質中引入脂肪酸鏈，可以有效降低DNA的凝聚濃度，并利用其疏水 性功能與DNA形成納米顆粒通過內吞作用進入細胞中，利于跨膜，采用該陽離子脂質形成的 轉基因載體具有低的細胞毒性，具有較高的轉染效率。基于這種發現，完成了本發明。
[0006] 本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優 點。
[0007] 本發明還有一個目的是提供一種具有多功能的大環多胺[12]aneN3陽離子脂質的 轉基因載體，不僅具有低的細胞毒性，而且同時具有較高的轉染效率，以促進基因治療的發 展。
[0008] 本發明還有一個目的是提供含大環多胺[12]aneN3的陽離子脂質的制備方法以及 含有該陽離子脂質的轉基因載體的制備方法。
[0009] 為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種含大環多胺[12]aneN3 的陽離子脂質，所述陽離子脂質的結構式(I)如下：
[0011]式(I)中，R為長鏈脂肪酸。
[0013]本發明的目的還可以進一步由大環多胺[12]aneN3的陽離子脂質的制備方法來實 現，該方法的合成路線如下：
[0015]其中，R如權利要求1所定義，所述方法具體步驟包括：
[0016]步驟一、向溶解有式1化合物的乙腈溶液中加入1，3_二溴丙烷，攪拌回流反應8~ 10小時，減壓濃縮除去溶劑得到黃色固液混合物，向其中加入乙醇和氫溴酸，攪拌回流反應 7~8小時，反應結束后，靜置，用水萃取有機層，合并水層，減壓濃縮得到淺黃色或者白色固 體，將固體真空干燥得到式2化合物，將式2化合物溶解于四氫呋喃中，于冰水浴中加入三乙 胺和叔丁氧羰基酸，室溫反應8~10小時，反應產物經柱層析分離得到式3化合物；
[0017]步驟二、所述步驟一得到的式3化合物與疊氮化鈉于N，N-二甲基甲酰胺中加熱反 應8~10小時，反應結束后，向體系內加入飽和食鹽水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有機相， 用飽和食鹽水洗滌有機相，用無水硫酸鈉干燥有機相后濃縮溶劑得到式4化合物；
[0018] 步驟三、將所述步驟二得到的式4化合物溶于無水的四氫呋喃與甲醇混合液，其 中，無水的四氫呋喃與甲醇的體積比為1:1，攪拌下向體系中加入催化劑，在氫氣氛圍下反 應8~10小時，反應結束后，減壓抽濾，濾液減壓濃縮得到式5化合物；
[0019] 步驟四、將所述步驟三得到的式5化合物與長鏈脂肪酸攪拌反應得到式6化合物；
[0020] 步驟五、將所述步驟四得到的式6與三氟乙酸攪拌反應得到式7化合物陽離子脂 質。
[0021] 優選的是，其中，在所述步驟四中，具體步驟包括:將長鏈脂肪酸溶解于三氯甲烷 中，加入二環己基碳二亞胺，于冰水浴下攪拌，待產生白色沉淀時，加入式5化合物與4-二甲 氨基吡啶，將混合物在冰浴下攪拌24小時后，減壓抽濾，得到濾液減壓旋干后加入乙酸乙 酯，在冰浴下再次攪拌〇. 5小時后，再次減壓抽濾，得到濾液旋干后進行柱層析，所述柱層析 采用的洗脫劑為乙酸乙酯與甲醇，其中，乙酸乙酯與甲醇的體積比為30:1。
[0022] 優選的是，其中，在所述步驟五中，具體步驟包括:將步驟四得到的式6化合物溶于 無水二氯甲烷中，于冰浴下，向其中滴加入溶有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，室溫下攪拌6小 時，反應結束后，將溶劑與過量的三氟乙酸減壓旋干，用二氯甲烷-正己烷重結晶得到式7化 合物陽離子脂質。
[0023] 優選的是，其中，在所述步驟二中，式3化合物與疊氮化鈉的摩爾比為1:1.5,加熱 反應的溫度為68°C。
[0024] 優選的是，其中，在所述步驟三中，所述催化劑為鈀碳催化劑，其中，式4化合物與 鈀碳催化劑的質量比為10:1。
[0025]為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，還提供了一種轉基因載體，所述轉 基因載體由大環多胺[12]aneN3的陽離子脂質、二油酰磷脂酰乙醇胺和高純滅菌緩沖液組 成，其中，所述陽離子脂質的摩爾濃度為2.OmM，所述陽離子脂質與所述二油酰磷脂酰乙醇 胺的摩爾比為1:2。
[0026] 本發明的目的還可以進一步由轉基因載體的制備方法來實現，該方法具體包括步 驟:將所述陽離子脂質、二油酰磷脂酰乙醇胺與無水氯仿加入到高溫滅菌的燒瓶中，溶解后 減壓濃縮得到轉基因載體膜，將所述轉基因載體膜真空干燥去除殘留氯仿，干燥后的轉基 因載體膜與預先預熱到70°C的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液混合配成所需濃度的溶液， 超聲得到所述轉基因載體，其中，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的摩爾濃度為10mM，pH為 7.4。
[0027] 本發明的目的還可以進一步由大環多胺[12]aneN3的陽離子脂質在制備轉基因載 體中的應用來實現。
[0028]本發明至少包括以下有益效果：
[0029] 1、提供含有脂肪鏈的陽離子脂質，可以有效降低DNA的凝聚濃度，并利用其疏水性 功能與DNA形成合適大小的納米顆粒通過內吞作用進入細胞中；
[0030] 2、通過含有脂肪鏈的陽離子脂質形成的轉基因載體細胞毒性較低，表現出很好的 轉染效果，有些甚至超過商品化的Lipofectamine2000,這為含[12]aneN3單元化合物作為 基因載體的進一步研究做了很好的鋪墊；
[0031] 3、陽離子脂質和轉基因載體的制備方法簡單、成熟、易于掌控；
[0032] 4、轉基因載體與細胞具有好的相容性，具有作為基因治療中非病毒載體的潛力；
[0033] 5、轉基因載體能全部包裹DNA，可作為DNA跨膜、轉運的良好載體；
[0034] 6、轉基因載體與DNA凝聚后的粒徑。與DNA形成100-250nm大小的顆粒，這為成功穿 入細胞膜實現基因轉染具有重要的意義。
[0035]本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本 發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發明的轉基因載體與DNA復合物的瓊脂糖凝膠電泳實驗結果示意圖；
[0037]圖2為本發明所述轉基因載體與質粒DNA的復合物在HepG2與A549細胞中的細胞毒 性圖；
[0038]圖3為本發明所述轉基因載體與質粒DNA的復合物的粒徑形貌圖；
[0039]圖4為本發明所述轉基因載體與DNA的復合物在A549細胞中的轉染圖片。
【具體實施方式】
[0040]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文 字能夠據以實施。
[0041]應當理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0042]〈實例1>
[0043] 一種大環多胺[12]aneN3的陽離子脂質，所述陽離子脂質的結構式如下：
[0045]式(I)中，R為長鏈脂肪酸。
[0047]陽離子脂質的方法，其合成路線如下：
[0048]
[0049]所述方法具體步驟包括：
[0050]步驟一、向溶解有式1化合物(3.0g，16.5mmol)的30.OmL乙腈溶液中加入1，3-二溴 丙烷(98.5mmo1 )，攪拌回流反應8~10小時，待瓶中有大量白色固體出現時停止反應。將乙 腈減壓旋蒸除去，得到黃色固液混合物。向得到的黃色固液混合物中加入15.OmL乙醇和 15.OmL氫溴酸，攪拌回流7-8小時;反應結束后，待反應溫度降為室溫，靜置，反應溶液分層， 收集水相，將下層有機相用水萃取3次，合并水層，采用乙醇旋蒸減壓將水大部分除去，得到 淺黃色或白色固體，將固體進行減壓抽濾，用冷的乙醇洗滌兩次后將白色固體放入真空干 燥箱中50°C干燥過夜，得到白色固體式2化合物8.0g，產率：90 %。取上述白色固體7.2g (1 3.5mmo1)，加入80 .OmL四氫呋喃溶解，在冰水浴下向混合液中加入8.0g三乙胺 (79.lmmol，6.0e.q·)與7.0g叔丁氧羰基酸(32.lmmol，2.4e.q.)，室溫下反應過夜。停止反 應，減壓抽濾，將濾餅用四氫呋喃洗滌3次，合并有機相，濃縮后得到粗產物柱層析分離提純 (乙酸乙酯:石油醚=1:10)，得到亮黃色固體式3化合物5.4g，產率82% ;
[0051] 步驟二、所述步驟一得到的式3化合物(0.5g，1.0mmol)溶解于N，N_二甲基甲酰胺 中，加入疊氮化鈉(〇.lg，1.5mmol)，反應加熱至68°C，反應8~10小時，反應結束后，向體系 內加入20.OmL飽和食鹽水，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌有機 相，用無水硫酸鈉干燥有機相后濃縮溶劑得到式4化合物(0.43g，0.95mmol)，產率:93%;
[0052] 步驟三、將所述步驟二得到的式4化合物(0.2g，0.44mmo1)溶于14.OmL無水的四氫 呋喃與甲醇混合液，其中，無水的四氫呋喃與甲醇的體積比為1:1，攪拌下向體系中加入鈀 碳催化劑0.02g，在氫氣氛圍下反應過夜，反應混合物減壓