轉化為半胱氨酸的雞抗體和使用其的位點特異性綴合的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用半胱氨酸殘基修飾的改造的雞抗體，更具體地涉及具有治療或診斷 疾病應用的抗體。半胱氨酸修飾的抗體可以與化學治療藥物、毒素、肽、親和配體（如生物 素）、和檢測標記(如放射性同位素和熒光團）綴合，并且用于診斷或治療疾病。
【背景技術】
[0002] 抗體廣泛用于診斷和治療。抗體可以通過與藥物、酶、染料、肽、適體、接頭、毒素、 同位素等化學結合而具有改善功能或可以具有新的功能。在與這些物質的化學結合中，涉 及到官能團如抗體的酪氨酸殘基的0H基團、賴氨酸殘基的NH 3基團，或天冬氨酸或谷氨酸的 羧基基團（文獻[Goldenberg D.M.等人，J .MecL (醫學雜志）（1978) 298: 1384-1386; Rainsbury R.M.等人，Lancet(柳葉刀）（1983)2:934_938;以及 Yamada H.等人， Biochemistry(生物化學）（1981 )20:4836-4842]) 〇
[0003]然而，這些官能團也存在于抗原結合位點中。因此，如果在化學結合中涉及抗原結 合位點中的殘基，可能會影響抗體對抗原的親和力。另外，在使用半胱氨酸的結合反應中， 抗體分子鏈(多肽）內或鏈之間的二硫鍵的還原是先決條件，其可以影響蛋白的活性(文獻 [Stimmel J.B.等人，J.Biol.Chem. (2000)273:30445-30450])。另外，蛋白可以由于三級結 構的錯折疊或損失而變得無活性或非特異性(文獻[Zhang W.等人，Anal.Biochem.(分析生 物化學）（2002)311:1-9])。
[0004]位點特異性綴合優于隨機的氨基修飾，因為其能夠在遠離結合位點的位點進行化 學修飾，促進生物學活性的完整保留和允許控制添加的輔基的可能數目。半胱氨酸改造的 抗體已通過接頭在新引入的半胱氨酸硫醇上綴合硫醇反應性接頭試劑和藥物接頭試劑，以 制備半胱氨酸改造的具有抗癌性能的抗體藥物綴合物，例如，抗MUC16(US 2008/0311134)， 抗CD220JS 2008/0050310)，抗R0B04(US 2008/0247951)，抗TENB20JS 2009/0117100)，抗 CD79B(US2009/0028856;US 2009/0068202)Thio ADC。然而，人或其他動物中存在一個或多 個抗體重鏈和輕鏈可變區基因，并且因此，每個不同的抗體具有不同的構架序列。因此，存 在的問題是，應當針對相應的抗體優化半胱氨酸引入位點。
【發明內容】
[0005] 技術問題
[0006] 本發明的一方面提供了雞抗體的構架片段，其中半胱氨酸殘基被引入到重鏈可變 區或輕鏈可變區中存在的構架區中，包括該構架片段的重鏈可變區或輕鏈可變區，或包括 該重鏈可變區或輕鏈可變區的抗體。
[0007] 本發明的另一方面提供了包括抗體或其抗原結合片段的綴合物和綴合化合物，所 述綴合物通過使例如化學治療藥物、酶、適體、毒素、親和配體、或檢測標記的綴合化合物與 雞抗體的構架片段、包括該構架片段的重鏈可變區或輕鏈可變區或包括該重鏈可變區或輕 鏈可變區的雞抗體中存在的引入的半胱氨酸殘基綴合來制備。
[0008] 又另一方面提供了包括抗體或其抗原結合片段的綴合物和綴合化合物在診斷或 治療疾病中的用途。
[0009] 技術方案
[0010]本發明人已經從雞抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的構架區中存在的多種氨基 酸殘基選擇了盡管被半胱氨酸取代也能夠維持抗體活性和親和力的殘基，并且還提供了雞 抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區中的構架片段、包括該構架的重鏈可變區或輕鏈可變區、 以及包括重鏈可變區或輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段，其中所述構架片段的特定氨 基酸被半胱氨酸修飾。
[0011] 優選地，引入半胱氨酸的位點不誘導在抗體分子之間形成二硫鍵，使得不形成二 聚體，或形成少量的二聚體。因此，維持了半胱氨酸的反應性。引入半胱氨酸的抗體或其抗 原結合片段容易地與綴合化合物(如化學治療藥物、酶、適體、毒素、親和配體或檢測標記） 結合，從而應用于診斷或治療疾病的各個領域。
[0012] 另外，根據本發明的半胱氨酸修飾的構架，包括該構架的重鏈可變區或輕鏈可變 區以及包括重鏈可變區或輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段源自雞抗體，并且雞抗體具 有一個重鏈可變區基因和一個輕鏈可變區基因，與人或其他動物的抗體不同。為此，所有抗 體具有相同的構架。因此，在根據本發明的半胱氨酸修飾的構架或包括該構架的抗體中，半 胱氨酸位于同樣的位置，并且因此同樣地應用于雞中產生的所有抗體。
[0013] 以下將更加詳細地描述本發明。
[0014] 根據本發明的實施方式的抗體是包括構架的抗體，其中源自雞抗體的重鏈可變區 和輕鏈可變區的構架區中存在的一個或多個氨基酸殘基被半胱氨酸取代。
[0015] 根據本發明的另一個實施方式的抗體是包括構架的抗體，其中源自雞抗體的重鏈 可變區和輕鏈可變區的構架區中存在的一個或多個氨基酸殘基被半胱氨酸取代，并且作為 取代的半胱氨酸兩側的側翼的兩個氨基酸中的一個或多個額外地被選自由天冬氨酸、谷氨 酸、精氨酸和賴氨酸組成的組中的一個或多個帶電荷的氨基酸取代。
[0016] 在本發明中，制備包括具有取代的半胱氨酸的構架的修飾的抗體通過使用具有一 個重鏈可變區基因和一個輕鏈可變區基因的雞抗體進行，因此在不分別優化半胱氨酸殘基 的引入位點的情況下可以迅速地制備半胱氨酸修飾的抗體，與人或其他動物的具有多種重 鏈和輕鏈可變區基因的抗體不同。
[0017] 在本發明中，抗體(半胱氨酸），其中源自雞抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的構 架區中存在的一個或多個氨基酸殘基被半胱氨酸取代，具有的優點是，兩個或更多個氨基 酸以及一個氨基酸被半胱氨酸取代，因此，兩個綴合化合物綴合在其上，或兩個或更多個不 同的綴合化合物綴合在其上以制備具有多種功能的綴合物。
[0018] 另外，根據本發明的修飾的抗體還具有的優點是，除了半胱氨酸取代外，作為被取 代的半胱氨酸兩側的側翼的兩個氨基酸中的至少一個氨基酸被選自由天冬氨酸、谷氨酸、 精氨酸和賴氨酸組成的組中的一個或多個帶電荷的氨基酸取代，從而有效地誘導與具有相 反電荷的物質的共價鍵，并且抑制在具有相同局部電荷的半胱氨酸修飾的抗體之間形成二 硫鍵以防止抗體聚集，并且用帶負電荷的天冬氨酸或谷氨酸取代氨基酸抑制了馬來酰亞胺 鍵的斷裂(文獻[Shen B.Q.等人，Nat.Biotechnol.(國家生物技術）（2012)30:184-189])。
[0019] 在本發明中，在可用半胱氨酸取代的位置的氨基酸是除半胱氨酸之外的氨基酸。 位于構架內的任何氨基酸均可被取代，只要其即使被半胱氨酸取代也能夠維持抗體活性和 親和力。
[0020] 滿足上述條件的待取代的氨基酸位于雞抗體的輕鏈可變區中存在的構架內，包括 SEQ ID N0:1 的構架 1、SEQ ID N0:2的構架2、SEQ ID N0:3的構架3、SEQ ID N0:4的構架4， 并且這些構架的結構如圖la詳細地示出。
[0021] 在本發明的實施方式中，修飾的抗體可以是僅包括輕鏈可變區的修飾的構架、僅 包括重鏈可變區的修飾的構架或包括輕鏈可變區的修飾的構架和重鏈可變區的修飾的構 架兩者的抗體。
[0022] 在雞抗體的輕鏈可變區中存在的構架中，待被半胱氨酸取代的氨基酸位于選自由 以下組成的組中的一個或多個位置:順序編號的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的位置3、4、5、 12、和16(與按照Kabat編號的位置5、6、7、14和18對應），
[0023] 順序編號的SEQ ID N0:2的氨基酸序列的位置31和40(與按照Kabat編號的位置37 和45對應），
[0024]順序編號的SEQ ID N0:3的氨基酸序列的位置52、53、56、58、59、60、61、64、65、71、 78 和 82(與按照 Kabat 編號的位置 57、58、61、63、64、65、66、69、70、76、83和87對應），以及 [0025] 順序編號的SEQ ID N0:4的氨基酸序列的位置98和102(與按照Kabat編號的位置 102和106對應）。
[0026]在輕鏈可變區中存在的構架內，可被半胱氨酸取代的氨基酸的位置如表la所示。 [0027][表la]輕鏈構架
[0028]
[0029]
[0030] 滿足上述條件的待取代的氨基酸位于雞抗體的重鏈可變區中存在的構架內，包括 SEQ ID N0:5的構架 1、SEQ ID N0:6的構架2、SEQ ID N0:7的構架3、SEQ ID N0:8的構架4， 并且這些構架的結構如圖la詳細地示出。
[0031] 在雞抗體的重鏈可變區中存在的構架內，待被半胱氨酸取代的氨基酸位于選自由 以下組成的組中的一個或多個位置:順序編號的SEQ ID N0: 5的氨基酸序列的位置1、3、5、 6、7、11、12、13、16、18、19、24和25(與按照1^匕&七編號的位置1、3、5、6、7、11、12、13、16、18、 19、24和25對應），
[0032] 順序編號的SEQ ID勵:6的氨基酸序列的位置42和48(與按照1^&&丨編號的位置42 和48對應），
[0033] 順序編號的SEQ ID勵:7的氨基酸序列的位置70、73、75、76、78、87、88、89、91和93 (與按照Kabat編號的位置69、72、74、75、77、83、84、85、87和89對應），以及 [0034] 順序編號的SEQ ID N0:8的氨基酸序列的位置123和126(與按照Kabat編號的位置 110和113對應）。
[0035]在重鏈可變區中存在的構架內，可被半胱氨酸取代的氨基酸的位置如表lb所示。 [0036][表lb]重鏈構架
[0037] 123 另外，在輕鏈可變區中，待被半胱氨酸取代的氨基酸可以優選地位于選自由順序 編號