一種a型h5n6亞型禽流感病毒雙通道實時熒光pcr檢測試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[00011本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種A型H5N6亞型禽流感病毒雙通道實 時熒光PCR檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 流感病毒是流行性感冒的病原體，屬于正粘病毒科，為RNA病毒，根據流感病毒核 蛋白（Nucleoprotein，NP)和基質1蛋白（Matrix protein 1，M1)抗原性的不同，流感病毒可 分為A、B、C三型，其中A型流感病毒是正粘病毒科的唯一屬，根據流感病毒表面血凝素 (hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分 為18個HA亞型（H1-H18)和11個NA亞型（N1-N11)，H5N1亞型禽流感病毒(Avian inf luenza virus，AIV)表示一個禽流感病毒具有H5型HA蛋白和N1型ΝΑ蛋白。因此，在理論上，根據目前 已知的18個ΗΑ和11個ΝΑ亞型可以組合形成198個亞型流感病毒.人感染Α型流感病毒通常局 限于3種HA亞型（H1，H2和H3)和2種NA亞型（N1和N2)，而家禽和野生鳥類通常作為其他亞型 流感病毒的天然宿主。許多跨物種傳播的禽流感病毒已經報道，如H5N1，H5N2，H9N2，H7N7， !17呢，!17似，!11(^7，!17冊和!11(^8，尤其是!15附和!17冊亞型禽流感病毒疫情造成了巨大的經 濟損失和人感染死亡病例。
[0003] 2014年2月，一種新型的H5N6亞型重配禽流感病毒造成人類感染，截止2015年7月， 全球共報告5例人感染病例，全部病例發生在中國大陸，另外在老撾、越南及中國大陸的禽 及禽類市場環境中已檢出H5N6亞型禽流感病毒，表明人感染H5N6亞型禽流感疫情形勢不容 樂觀。為了有效地控制人感染H5N6亞型禽流感疫情，早期、快速、特異和敏感的檢測方法研 究成為當務之急。目前針對H5N6亞型禽流感病毒的檢測主要依賴病毒培養、核酸檢測和基 因測序等方法，其中實時熒光PCR方法因具有快速、特異、敏感的特點，已成為各大研究機構 和生物試劑公司優先研究開發的重點方向.
[0004] 隨著分子生物學的快速發展，實時熒光PCR技術在流感分子診斷領域發展最快。 2004年Jurgen A.Richt等利用real-time RT-PCR技術進行了北美豬流感病毒的型別和亞 型的分子診斷，該體系每次只能進行一個型別或亞型的診斷.2006年multiplex PCR技術 被用于呼吸道病毒的分子診斷.2007年有人利用2套multiplex PCR對12種呼吸道病毒進行 了分子診斷，但這兩種方法都靠凝膠電泳進行結果分析，且自身存在靈敏度差、易交叉污染 等不足。2007年real-time PCR被用于同時進行人禽流感病毒H5N1亞型的分子診斷.2008年 多重real-time PCR開始被用于常見呼吸道病毒的分子診斷.2009年多管多重熒光定量PCR 被用于檢測新甲型H1N1流感病毒和季節性流感病毒.2010年單管多重熒光定量PCR開始被 用于流感病毒亞型分型.但因為流感病毒的多變性，目前尚沒有針對新近發現的A型H5N6流 感病毒的單管多重熒光定量PCR試劑盒和診斷方法的報道.
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一在于提供一種快速、特異性強、靈敏度高的A型H5N6亞型禽流感 病毒雙通道實時熒光PCR檢測試劑盒，可用于H5N6亞型禽流感病毒的監測和臨床診斷。
[0006] 本發明所述檢測試劑盒具體包括以下組分：
[0007] (l)RT-PCR反應液：含有50mM MgS〇4、0.4mM dNTPs;
[0008] (2)引物和探針混合液:包含H5及N6特異性引物、探針，其中H5-F和N6-F引物濃度 均為20yM，H5-R和N6-R引物濃度均為40μΜ，Η5和N6探針濃度為20μΜ;擴增特異性引物的序列 如下：
[0009] Η5上游引物H5-F:5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3(Seq ID No:l);
[0010] H5下游引物H5-R:5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3(Seq ID No:2);
[0011] H5特異性探針H5-probe: 5-熒光報告基團-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-熒光猝滅基 團-3(Seq ID No:5);
[0012] N6上游引物N6-F:5-CTAGGGTCGARTGCATAGGATG-3(Seq ID No:3);
[0013] N6下游引物N6-R:5-TACCACACYACTGCCGATGC-3(Seq ID No:4);
[0014] N6特異性探針N6-probe:5-熒光報告基團-AAGCACGTCATGCCAYGATG-熒光猝滅基 團-3(Seq ID No:6);
[0015] (3)酶混合液:含有逆轉錄酶、Taq酶；
[0016] (4)陽性標準品為含H5N6亞型禽流感病毒特異性HA和NA基因片段DNA濃度分別為 3.6 ng/yL和3.3ng/yL的質粒混合物；
[0017] (5)陰性標準品為ddH2〇。
[0018] 上述A型H5N6亞型禽流感病毒HA和ΝΑ基因的雙通道核酸檢測試劑盒擴增反應液每 管20.0 yL，最優組成為:RT-PCR反應液16. OyL、引物和探針混合液3. OyL、酶混合液1. OyL.
[0019] 本發明的雙通道熒光PCR檢測用引物具體包括兩對引物及其各自對應的探針，分 別擴增、檢測H5基因和N6基因.
[0020] 本發明的探針一端標記有熒光報告基團，探針另一端標記有熒光猝滅基團，熒光 報告基團可以為常見的所述的熒光報告基團包括:MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、 NED、TET、R0X或CY5;熒光猝滅基團包括:了六11^、8即1、8即2，兩條探針的熒光報告基團不相 同即可.優選的，H5探針標記的焚光報告基團為FAM焚光基團，N6探針標記的焚光報告基團 為Hex，所述的熒光猝滅基團均為BHQ1.
[0021] 本發明的酶混合物，由逆轉錄酶和Taq酶組成，所述的逆轉錄酶為鼠白血病病毒逆 轉錄酶，Taq酶為常見的耐熱Taq聚合酶。兩種酶的濃度分別為2IU/yL和2IU/yL。
[0022] 本發明的反應體系中，所述的RT-PCR反應液、引物和探針混合液、酶混合液可以分 開單獨保存，也可以混合在一起，優選混合在一起保存.
[0023]本發明所述的陽性標準品，可以為含有H5基因和N6基因的DNA片段，該DNA片段可 以為PCR擴增后產物、質粒、人工合成基因.
[0024] 本發明樣本核酸的提取，可參考現有病毒RNA提取技術，優選試劑盒提取法。
[0025] 本發明試劑盒的PCR擴增程序為:①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55 °C45sec，其中③-④循環40次，熒光收集在步驟④。
[0026] 本發明的另一目的在于提供一種利用本試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟： [0027] (1)病毒RNA的提取；
[0028] (2)試劑配置:在標明編號的PCR反應管中加入擴增反應液16.OyL、引物和探針混 合液3. OyL、待檢模板5. OyL和酶混合液1. OyL;陽性標準品反應管和陰性標準品反應管中各 加入5.0μΙν^準品；
[0029] (3)PCR擴增：將上述PCR反應管混勻、離心后置于熒光定量PCR儀上，設置擴增程 序：①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55°C45sec，其中③-④循環40次，④收集 信號.
[0030] (4)PCR反應結束后，檢測PCR反應體系的熒光信號值，閾值設定原則以閾值線剛好 超過陰性標準品樣本熒光值最高點，熒光通道優先FAM和HEX通道.
[0031] 結果判讀:在儀器正常、陽性標準品和陰性標準品均正常的情況下進行結果分析， 陽性標準品Ct < 35.0，陰性標準品Ct 2 38.0，PCR擴增有效.
[0032] FAM通道：1)陽性:待測樣本檢測結果Ct< 35.0,擴增曲線呈S型且有明顯指數增長 期，判斷為H5亞型禽流感病毒陽性;2)陰性:待測樣本檢測結果Ct>38.0,判斷為H5亞型禽 流感病毒陰性;3)可疑:待測樣本結果35.0<Ct<3