一種鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的引物、探針及鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及涉及生物技術領域，尤其涉及一種鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型 的引物、探針及鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 珊瑚礁具有巨大的生態和經濟價值，據估計，珊瑚礁作為三分之一海洋生物的棲 息地，并承擔超過25 %的海洋生產力。然而，近年來由于全球氣候變暖，引起海水溫度上升、 海水酸化以及海洋環境的污染等，使造礁珊瑚面臨一系列重大的威脅。我國的珊瑚礁主要 分布在南海，環礁為主，海南島、廣東省和臺灣島沿岸分布有岸礁。由于我國珊瑚礁的保護 區的設立和保護措施相對落后，加上人為破環嚴重、氣候環境變化等因素，我國的珊瑚礁同 樣面臨"白化"及珊瑚多樣性驟減等不容樂觀的形勢。
[0003] 珊瑚"白化"現象加速珊瑚的死亡，可以被視為一種有害的生理反應或疾病，目前 普遍認為是由于珊瑚失去體內共生的Symbiodinium或者"Symbiodinium-Symbioses"，導致 之間的協同共生的關系遭到破壞或者難以維持。Symbiodinium通過光合作用固定C〇2,可以 為珊瑚生長和"鈣化"提供必要的碳源，此外，藻類還能產生MMA(菌孢類氨基酸），能有效的 阻擋紫外線，為珊瑚在海洋環境的生長提供保護。目前，國際上對珊瑚共生光合藻類的鑒定 還沒有統一的標準，很難在形態上進行準確的鑒定。由于分子生物學的發展，使用分子鑒定 的方法對珊瑚共生藻類的分類鑒定有了較大的突破。以ITS序列進行比對分析，可以大體將 珊瑚共生光合藻類分為Clade六3，(：，〇3和?六種類型。經調查，在中國海域，珊瑚共生的光 合藻類主要為Clade C。由于海水溫度隨季節性動態變化，在遇水溫升高的情況下，具有低 耐熱性、溫度敏感性高的共生藻類的細胞豐度會出現相對下降。為此，如何對珊瑚共生溫度 敏感型的光合藻類定量檢測鑒定，計算珊瑚組織共生藻類細胞的動態變化，對研究光合藻 類與珊瑚的互作和珊瑚白化防控防治具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的引物和探針。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供一種鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的引物和探 針，其特征在于，所述引物為SEQ ID N0:2-3,探針為SEQ ID N0:4;
[0006] 或引物為SEQ ID NO:5-6,探針為SEQ ID NO:7;
[0007] 或引物為SEQ ID NO:8-9,探針為SEQ ID NO: 10;
[0008] 或引物為SEQ ID NO:11-12,探針為SEQ ID NO: 13;
[0009] 或引物為SEQ ID NO:14-15,探針為SEQ ID NO: 16;
[0010] 或引物為SEQ ID NO:17-18,探針為SEQ ID NO: 19;
[0011] 所述探針的5 '端、3 '端分別用FAM報導熒光染料和TAMRA淬滅基團標記。
[0012] -方面，本發明還提供一種用于鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的試劑盒，其 特征在于，含有所述的引物和探針。
[0013] -方面，本發明還提供所述的試劑盒用于鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的用 途。
[0014] -方面，本發明還提供一種用于鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的方法，其特 征在于，采用所述引物和探針或所述的試劑盒。
[0015] -方面，本發明還提供一種用于鑒定珊瑚共生光合藻類溫度敏感型的方法，其特 征在于，步驟為，
[0016] 提取光和藻類DNA;
[0017] PCR 擴增；
[0018] 結果判定。
[0019] 進一步，所述PCR擴增的程序為：90-100°C，30-60S; 90-100°C，5-30S，50-70°C，20-90s，20~50個循環，在每個循環的延伸結束時進行焚光信號檢測，焚光模式設為FAM;淬滅 基團設為TAMRA。
[0020] 進一步，所述PCR擴增的體系為，1/10體積的10倍PCR反應緩沖液，dNTP各0.1~ 0.5mmol/L，Taq DNA聚合酶0.1~5國際單位，探針0.1~0.5mmol/L，分離純化的DNA模板液 0.1~10ng，上下游引物各0.2~2mmol/L，加無菌去離子水使總體積達到10~100μΙ。
[0021 ]進一步，所述如果Ct值在0-40之間，優選的，Ct值在0-38之間；判定為陽性，表示樣 品檢出珊瑚共生光合藻類的溫度敏感型為Clade C;
[0022] 如果Ct值為0或者大于等于40,判定為陰性，表示樣品未檢出珊瑚共生溫度敏感型 光合藻類。
[0023] 進一步，還包括根據標準曲線，依據Ct值計算出溫度敏感型為Clade C共生藻的 DNA濃度值Y;所述標準曲線為Y clade C = -0.2572+4.8699，R2 = 0.9984。
[0024] 所述珊瑚共生溫度敏感型的光合藻類CladeC，是指在中國海域，珊瑚共生的光合 藻類主要為CladeC，具有在溫度高于30°C下不能生長的對高溫敏感的光合藻類類型，其檢 測鑒定特征序列為：
[0025] CCCAGACAGTTGTCACTAAAGCAGCTTAGCCTTCATTCCCCGGCCCGCTGAACACGGACCCATGGCCACAGAGCGAC ACTCGCACCAGCCCCAACAAGGGTTGGTGAGTGTGCAT〇 SEQ ID N0:1。
[0026] 本發明主要依據物種的基因序列特異性，利用這段序列的分子標記可以特異的鑒 定共生光合藻Clade C，同時區別于非C型的珊瑚共生藻。另外經過前期的序列比對及實驗 驗證，通過這段序列GC含量介于45-60 % ;長度介于100-150bp;擴增效率高。設計所得的引 物不易形成二聚體；引物的退火溫度60°C，探針的退火溫度68°C以上，二者相差8°C，探針適 合攜帶熒光標記等因素。
[0027] 為了實現上述目的，本發明的珊瑚共生溫度敏感型的光合藻類CladeC分子檢測方 法，首先是依據CladeC類型的特征序列，設計用于實時定量TaqmanPCR的若干引物和Taqman 探針組合FAM-CladeC。
[0028] 申請人對中國海域的珊瑚光合藻類分離，培養研究發現，Clade C總體的分裂、生 長速度均比Clade A和Clade F低。但Clade C在高溫條件下（高于30°C)基本停止分裂，而在 低于28°C下，其分裂、生長速率明顯快于30°C。說明Clade C是溫度敏感型的類型。此與最近 海洋氣候變暖及珊瑚白化在中國海域的發生，特別是秋冬季節的發生密切相關。
[0029] 為了確保參試藻種為珊瑚共生光合藻類的溫度敏感型CladeC，本發明通過離體純 化培養和ITS - PCR方法對所采集的樣品進行了藻類CladeC的鑒定。
[0030] 本發明的優點：本發明以溫度敏感型藻種CladeC的ITS序列易變異區設計特異引 物和TanMan探針組合(FAM-Clade C)，通過TaqmanPCR技術可實現對溫度敏感型藻種Clade C的快速定量檢測和類型的準確鑒定。
[0031] 珊瑚共生光合藻類溫度敏感型(Clade C)的鑒定及檢測技術對珊瑚的保護及修復 有重要的研究及應用意義。研究認為，在目前全球氣候變化及海洋溫度變暖的趨勢下，珊瑚 為應對這種氣候的變化，可能通過采取馴化或者重新選擇能夠適應高溫環境的共生藻。而C 型屬于溫度敏感型共生藻，不是一種應對高溫的優勢共生藻類。如果上述假說成立的話，對 于珊瑚保護及修復具重大的指導意義。但是如何驗證這種假說，需要一項足夠靈敏以達到 評價珊瑚應對溫度變化（因為海洋溫度的變化是微小的，通常只有〇.l-l°C的變化，而在這 樣小范圍的溫度變化，珊瑚共生藻的變化也是微小，循序漸進的過程）的技術，以衡量共生 藻C的群體及豐都的變化趨勢。本發明以此為立足點，具有相應的研究應用價值。
[0032] C型共生藻是存在于我國海域珊瑚的最主要共生藻類型。而我國的珊瑚'白化'現 象逐年加劇，情況不容樂觀。珊瑚保護缺乏相關的法規及行業標準，急需一種可以針對評價 我國珊瑚共生藻的新技術。本發明所鑒定的珊瑚共生藻C型采集來源于我國南海，以我們海 域的共生藻的基因序列設計特異的針對C型的標記，作為定量PCR鑒定的依據。同時區別于 其他非C型的共生藻，保證了鑒定及檢測的特異性。對我國的珊瑚保護具有相當的應用價 值。本發明以此目的為