鑒別當歸早薹的dna分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種當歸早薹的鑒別方法，具體涉及一種鑒別當歸早薹的DNA分子標 記序列及其具體應用。
【背景技術】
[0002] 核酸序列的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于藥用植物特異性狀的分 子標記以及在藥用植物的種質選育具有重要意義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法 有生理、生化指標的檢測、顯微檢測等方法，這些方法需要復雜的操作和特殊的設備。1993 年PE公司的Dr.Kary B.Mullis發明了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡 稱PCR。隨后PCR技術大規模的應用于生物研究和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新時代。
[0003] 擴增片段產度多態性(AFLP)分析技術基本原理是先利用限制性內切酶水解基因 組DNA產生不同分子量的DNA片段，再使用雙鏈人工接頭和酶切片段相連接，連接產物作為 擴增反應的模板DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基 礎上添加1-3個選擇性核苷酸作引物對模板DNA基因再進行選擇性擴增，一般以DNA作為模 板需要添加3個選擇性核苷酸作為引物分離效果較好。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 檢測選擇性擴增獲得的DNA片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態性。引物由三部分組 成：與人工接頭互補的核心堿基序列、限制性內切酶識別序列、引物3'端的選擇堿基序列 (l_3bp)。該技術的獨特之處在于所用的專用引物可在不知道DNA信息的前提下就可對酶切 片段進行PCR擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個限制性內切酶，一個酶為多 切點，另一個酶切點數較少，因而AFLP分析產生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP具 有分辨率高、穩定性好、效率高的優點。AFLP高效可靠的特點使它在基因組研究中有廣闊的 應用前景。
[0004] 當歸早薹影響當歸的產量和品質，因此選育出優良品種的當歸具有重要意義，但 是目前關于當歸早薹的鑒別方法未見報道。
【發明內容】
[0005] 發明目的：本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種鑒別當 歸早薹的DNA分子標記和其應用。
[0006 ]技術方案，為了解決以上問題，本發明采取的技術方案為：
[0007] 鑒別當歸早薹的DNA分子標記，所述的DNA分子標記是通過擴增片段長度多態性分 析技術研究早薹當歸和正常當歸在基因組學水平的差異，獲得早薹當歸的特異分子標記片 段，并通過PCR和測序技術對差異片段的序列進行分析，獲得DNA分子標記ZT-1、ZT-2和ZT-3,它們的序列分別為SEQ ID No:l，SEQ ID Νο:2和SEQ ID Νο:3。
[0008] SEQ ID No :1 的序列為：
[0009] CAAGCAAACCATTGTAGATGGGGTTACTTTTGCACCTAACAACATTGTTGCTTTGTTAGATCATAAGGATTTCCCTA GTGATTTTCATATCATTCAGGATTTCCTCGCCTGTAGTCCATTGAACTTTGCTCTAACTCAACCTTTGAAGGTTTCG TGTAAGAGTGTTATGCAGGTATGGACCACTGCTAAGTTTGCGAAGCTGGCATCGTCAGGACAGCTCCACATGTCGTT TGTTCACAATGGGACTGTCTATGGGGTCACTCCTGAAGTTGTAGAAGATGCACTCCAATTACCCAAGCTCGGTACTA o
[0010] SEQ ID No :2的序列為：
[0011] CATCCAGATGTACCTGCAAAGAAATTTCCTTGTCAAAGACAAGTTGCTGACCAGTCCCGTAGGCTGATCCTTCCCTT AGAGGGTACCATAGGATTTAAGTCTGGTAGGGTATACGAGGGTTCTGTAGTTAGCTAGAATCCCAAGTTTCACTTGA CGCCTGTGAAGGCACTTGGTTCATGGAACCACTAACCGTTGTCATTGACCATGAAATGGTTGAACAAATAGTTGCTT CCATCAACTTTTCCTCTGTGTGT 〇
[0012] SEQ ID No :3的序列為：
[0013] AGTCCTAGAGTACCTAGGCGGAGTACAATTGTTTGTAGAGCACTATCTTGAGTTTTCTTGTTGTCTGAGCATTGATG TTATCTGAGGTTTACCTCACATATTTTATTGAAACTTCTTCCTCAAAATTCCGGAAGAAGGGTGATGGTTATTGGGT GT〇
[0014] 作為優選方案，以上所述的鑒別當歸早薹的DNA分子標記，對早薹當歸和正常當歸 進行基因組水平多樣性分析，在6%的聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳，電泳結果用硝酸銀染 色，染色后的聚丙烯酰胺凝膠比較早薹當歸和正常當歸基因組水平差異，割取差異明顯、分 子量較大的片段，獲得早薹當歸的特異分子標記片段。
[0015] 本發明所述的DNA分子標記在早薹當歸的種質鑒定中的應用。
[0016] -種早薹當歸的種質鑒定試劑盒，其含有本發明提供的DNA分子標記。
[0017] 有益效果:本發明提供的鑒別當歸早薹的DNA分子標記具有以下優點：
[0018] 本發明采用AFLP篩選當歸和早薹性狀相關的分子標記，通過大量實驗建立、優化， 摸索出適合當歸種的AFLP的反應體系及銀染反應體系，獲得清晰的DNA指紋圖譜，并在此基 礎上篩選當歸早薹的分子連鎖標記。本發明優選得到的早薹當歸種質中的特異性DNA序列， 序列可以應用于早薹當歸的種質鑒定，對選育抗早薹品種的當歸具有重要意義。本發明提 供的當歸早薹的DNA分子標記穩定性好，重復性好。
【附圖說明】
[0019] 圖1為基因組DNA電泳圖。
[0020] 圖2為早薹和正常當歸選擇性擴增產物變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
[0021] 圖1中1為正常當歸;2為早薹當歸；圖2中ZC:正常生長當歸;ZT:早薹當歸。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各 種等價形式的修改均屬于本申請所附權利要求所限定的范圍。
[0023] 實施例1
[0024]當歸早薹的DNA分子標記序列篩選方法：
[0025] 1.當歸基因組總DNA提取
[0026] 提取植物基因組DNA用改良的CTAB法。稱取當歸葉片1 g，用液氮充分磨成粉末，收 集粉末于離心管中，加4mL預熱至65°C的CTAB提取液，65°C保溫lh。加入等體積氯仿/異戊醇 (24:1)抽提、顛倒使混勾，5500rpm/min離心10min，取上清液，重復抽提2-3次。吸取上清液 加入2/3體積預冷的異丙醇，在-20°C靜置211。750(^離心10min，沉淀用400yLTE溶解，加入預 煮沸的RNase A 4yL，37°C保溫30min。再用等體積氯仿/異戊醇(24:1)抽提1-2次，取上清液 加入等體積異丙醇沉淀DNA，輕搖管子混勻至出現白色絮狀沉淀。用牙簽挑出DNA，放入800μ L76 %乙醇、0.2Μ乙酸鈉中洗滌20min，將牙簽及其上的DNA在70 %冷乙醇中洗滌幾秒鐘后放 入一支裝有300yLTE的1.5mL離心管中，輕搖，4°C下過夜使DNA溶解。分裝，置于-20°C長期保 存。
[0027] 2.DNA濃度與質量測定 [0028] (1)瓊脂糖電泳法
[0029]將提取的模板DNA在1 %瓊脂糖凝膠電泳上檢測，以1 X TAE為緩沖液，指示劑為溴 酚蘭，電泳結束后EB染色，膠塊于成像系統中觀察照相，如圖1所示。純的DNA樣品在紫外線 下應呈現一條迀移率很小的整齊條帶。如果溴酚蘭前有彌散的熒光區出現，則表明樣品中 存在RNA雜質，若DNA在凝膠上不形成清晰的條帶，而只是彌散的一片，則表明DNA已嚴重降 解。
[0030] (2)紫外分光光度法
[00311取50yL DNA溶液稀釋20倍，以雙蒸水為對照用紫外分光光度計測定波長為260、 280nm下的光吸收值。DNA濃度(yg/yL)按0D260 X 50/1000 X稀釋倍數計算；純度按0D260/ 0D280之比值判斷。純的DNA溶液其0D260/0D280應在1.9-1.6之間，如0D260/0D280大于1.9 時，表明有RNA污染，小于1.6則表明有蛋白質或酚類物質污染。
[0032] 3.AFLP方法的建立
[0033] AFLP體系及程序參照Vo s等的方法。
[0034] (1)酶切反應
[0035] DNA用EcoRI和Msel雙酶切，37°C過夜，65°C2小時。反應體系：DNA200ng，10X Buffer2yL，MseI0 · 3yL( lOU/yL)，EcoRI0 · 25yL( lOU/yL)，加 ddH20至總體積 10yL。
[0036] (2)連接反應
[0037]
[0038]
[0041]
[0042] 預擴增條件：94°C變性3min; 94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin( 26個循 環）；72°C延伸5min。反應體系:模板]^1^(：〇1?1(1001^凡)預擴引物0.3以1^，]\1861(100即凡)預 擴引物0 · 3yL，Buffer 2yL，dNTP (1 OmM) 0 · 4yL，MgC 12 (25mM) 1 · 2yL，Tag酶（5U/yL) 0 · 2yL，加 ddH2〇至總體積20yL。
[0043] (4)預擴增產物為模板進行選擇性擴增
[0044]
[0045]優化選擇性擴增反應條件，設立模板濃度梯度、酶離子濃度梯度、dNTP濃度梯度； 擴增結果電泳檢測。選擇性擴增條件:94°C變性3min; 94°C變性30s，65°C退火30s (每次循環 下降0.7°C)，72°C延伸lmin( 13個循環）；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin(24個循 環）；72°C延伸5min。
[0046] (5)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
[0047] 參照優化條件進行早薹、正常當歸基因組水平多樣性分析。選擇性擴增產物在6% 的聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳，電泳結果硝酸銀染色。如圖2所示。
[0048] 4.差異表達片段的分離和再擴增 [0049] (1)差異表達片段的分離
[0050]染色后的聚丙烯酰胺凝膠比較早薹和正常當歸基因組差異，割取差異明顯、分子 量較大的片段。50yL ddH20溶解，95°C加熱15min，4°C過夜，_20°C冷凍保存。
[0051 ] (2)差異片段的PCR擴增
[0052] 2yL差異片段溶解液作為反