用于肝癌術后預后評估的試劑盒和肝癌化療增敏劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種肝癌術后預后評估試劑盒和肝癌化療增 敏劑。
【背景技術】
[0002] 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）是一種嚴重威脅我國 人民生命與健康的惡性腫瘤性疾病。在世界范圍內，肝癌已經成為第三大癌癥相關死亡原 因。近年以來，與肝癌相關的影像學診斷技術和外科手術技術不斷提高。以sorafenib為代 表的肝癌靶向治療藥物也獲得了美國食品與藥品管理局的批準。這些成果為肝癌的診斷與 治療提供了更多更有效的選擇。但遺憾的是，綜觀當前肝癌臨床治療的現狀，肝癌病人的術 后五年生存率并沒有顯著提高。
[0003] 目前，外科手術仍然是肝癌的首選療法。但由于肝癌發病病程長，起病隱匿，一部 分病人在確診時就已經錯過了用手術的方法根治肝癌的最佳時機。術后預后不良的病人不 得不繼續采取化學治療的辦法來鞏固療效。而不幸的是，肝癌細胞容易對化療藥物產生耐 藥性，抗腫瘤藥物化療藥物本身對機體也可能造成較大的毒副作用，故化學治療的預后至 今仍難以令人滿意。如能提高肝癌細胞對化療藥物的敏感程度，就可以減少化療藥物的給 藥量而盡量地控制藥物的毒副作用。故提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性也就成為肝癌臨 床治療的關鍵性難題之一。因此，為了給肝癌的早期預防、術后預后評價和化療增敏提供新 的靶點，深入研究肝癌發生發展過程中涉及到的分子機理具有十分重大的意義。
[0004] 微小RNA(microRNAs，簡稱miRNAs)是一種長度約為20~25個核苷酸的非編碼小 RNA^iRNA可以通過誘導mRNA降解或者抑制mRNA翻譯等途徑下調靶蛋白的表達水平。這類 非編碼RNA參與了許多生理與病理過程。一些miRNA的表達異常則在包括肝癌在內的一系列 腫瘤性疾病的發生發展過程中扮演了重要角色。miRNA在肝癌的早期診斷、預后評估和靶向 性治療等領域的特殊意義也正吸引著越來越多學者的關注。miR-653在2006年左右就被鑒 定到，但目前尚缺乏對其生物學功能的系統研究，對miR-653與肝癌發生和預后的相互關系 的認識亦尚不明確。
[0005] 迄今為止，尚未存在一種以miR-653為生物標志物的肝癌術后預后評估試劑盒，也 沒有以miR-653為有效成分的肝癌化療增敏劑。
【發明內容】
[0006] 本發明基于本領域存在的上述缺陷和空白，提供了一種以miR-653為主的肝癌術 后預后評估標志物，以及一種以miR-653為有效成分的肝癌化療增敏劑。
[0007] 本發明的技術方案如下：
[0008] 用于肝癌術后預后評估的試劑盒，其特征在于，包括用于定量檢測待測肝組織中 微小RNA分子miR-653表達水平的試劑;所述miR-653的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示。 [0009 ]所述試劑包括實時定量PCR檢測所述微小RNA分子miR-653所需的檢測引物。
[0010] 還包括用于對微小RNA分子miR-653進行反轉錄的反轉錄引物，其序列如Seq ID No. 3所示。
[0011] 所述檢測引物包括上游引物:5 ' -GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3 '，和
[0012] 下游引物：5' -GCGTTCGAACAGCTGCCT-3'。
[0013 ]還包括RNA提取試劑、緩沖體系、反轉錄試劑、PCR擴增試劑。
[0014]采用上述試劑盒的方法中，所述PCR擴增的反應體系推薦為:2XAllinone? qPCR MixO. 5yL/yL，上游引物0.02μΜΛΛ，下游引物0.02μΜΛΛ，第一鏈cDNA 0.02μΜ/μL，其余為雙 蒸水；
[0015]所述PCR擴增的反應程序推薦為:95度10分鐘；以95度10秒，57度20秒，72度10秒為 一個循環，共30個循環。
[0016] -種肝癌化療增敏劑，其特征在于，其有效成分包括人工制備的微小RNA分子miR-653 、 微小 RNA 分子 miR-653 的前體 ，或可在肝癌組織中 有效表達微小 RNA 分子 miR-653 和 /或 miR-653前體的過表達載體；
[0017] 所述微小RNA分子miR-653的核苷酸序列如Seq ID No. 1所不；所述微小RNA分子 miR-653前體由Seq ID No.2所示的DNA序列編碼。
[0018] 所述過表達載體指真核表達載體或病毒載體；
[0019] 所述真核表達載體指pCMV-Myc表達載體、pEGFP表達載體或PCDNA3.0系列表達載 體；
[0020] 所述病毒載體指逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或慢病毒載體。
[0021] 微小RNA分子miR-653在制備肝癌化療增敏藥物中的應用，所述微小RNA分子miR-65指人工制備的微小RNA分子miR-653、微小RNA分子miR-653的前體，或可在肝癌組織中有 效表達微小RNA分子miR-653和/或miR-653前體的過表達載體;所述微小RNA分子miR-653的 核苷酸序列如Seq ID No. 1所示;所述微小RNA分子miR-653前體由Seq ID No. 2所示的DNA 序列編碼。
[0022] 所述過表達載體指真核表達載體或病毒載體；
[0023] 所述真核表達載體指pCMV-Myc表達載體、pEGFP表達載體或pcDNA3.0系列表達載 體；
[0024]所述病毒載體指逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或慢病毒載體。
[0025]本發明發明人發現miR-653在正常肝組織中以及肝癌組織中的表達量上存在顯著 差異，并發現過表達miR-653明顯增強肝癌細胞對化療藥物sorafenib誘導凋亡的敏感程 度。基于這些發現，本發明供了一種用于肝癌術后預后評估的試劑盒，該試劑盒包括用于定 量檢測待測肝組織中微小RNA分子miR-653的表達量所需的試劑。對于本領域技術人員而 言，定量檢測一種已知的微小RNA分子的表達量可以有多種可選方法。比如可選實時定量 PCR，其中涉及引物設計，對于本領域技術人員而言，針對一段已知序列設計引物是常規實 驗技能。
[0026] 在本發明的優選實施方式中，提供了一些用于實時定量per的引物，其中一對如 下：
[0027] 上游引物：5 ' -GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3 ' ；
[0028] 下游引物：5 ' -GCGTTCGAACAGCTGCCT-3 '。
[0029]本發明提供的試劑盒還可以包括用于檢測RNA表達量的其它常規試劑。
[0030] 還包括用于對微小RNA分子miR-653進行反轉錄的反轉錄引物，其序列如Seq ID No. 3所示。
[0031]基于發明人的發現，本發明還提供微小RNA分子miR-653在肝癌化療增敏劑中的制 藥用途。
[0032] 肝癌化療增敏劑/藥物中，以miR-653、和/或miR-653前體、和/或miR-653過表達載 體為有效成分。在一些具體的實施例中，所述miR-653過表達載體指，miR-653和/或miR-653 前體與載體連接的產物。miR-653的序列SEQ ID NO: 1由21個核苷酸組成，其末端核苷酸可 與靶基因 mRNA的3'非翻譯區中相對應的靶向序列形成約7個核苷酸的堿基互補匹配，形成 種子序列（seed sequence)。
[0033] miR-653前體的序列SEQ ID N0:2,經適當的載體(可以選自一般真核表達載體或 者病毒相關載體)轉染入哺乳動物細胞進行表達后，可被最終加工為成熟的miR-653(即SEQ ID N0:1 所示的RNA)。
[0034] 所述藥物可以直接體內施用（in vivo途徑）：miR-653或者編碼SEQ ID No.2所示 的DNA的載體直接導入體內。這種載體可以是一般真核表達載體或者病毒相關表達載體，制 成制劑的DNA或RNA甚至是裸DNA或RNA。一般真核表達載體可以是任何適當的表達載體，包 括但不限于pCMV-My c表達載體、pEGFP表達載體、pcDNA3.0系列表達載體等載體或者在已知 的表達載體基礎上經改造而成的載體。
[0035] 所述肝癌術后預后評估試劑盒，還包括RNA提取試劑、緩沖體系、反轉錄試劑、PCR 擴增試劑、針對miR-653的引物對和使用說明書。
[0036] 本發明請求保護上述試劑盒的制備方法，任何出于商業目的的制造和/生產所述 試劑盒的行為都落入本發明的保護范圍。所述行為指，組裝所述試劑盒的試劑中包括用于 PCR擴增miR-653的cDNA的引物;和/或，在標有肝癌術后預后評估用途的產品包裝內放置用 于PCR擴增miR-653的cDNA的引物。
[0037] 需要的時候，本發明的所述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。 所述"藥學上可接受的載體"包括但不限于包囊劑、混懸劑、緩沖劑、乳劑、稀釋劑、顆粒劑、 粘合劑、賦形劑、噴霧劑、填充劑、崩解劑、濕潤劑、透皮吸收劑、吸收促進劑、表面活性劑、著 色劑、矯味劑或吸附載體等。而所述藥物可以制成包括但不限于注射液、片劑、膠囊劑、顯微 注射劑、適于轉染的劑型、粉劑、粒劑等劑型。以上提到的各種劑型藥物均可依據藥劑學領 域的常規方法制備。
[0038] 本發明中所述的"受試者"可以