檢測OSTC基因mRNA的可變腺苷酸位點使用情況的引物及方法

檢測OSTC基因mRNA的可變腺苷酸位點使用情況的引物及方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及病毒檢測技術領域，尤其涉及檢測0STC基因 mRNA的可變腺苷酸位點使 用情況的引物及方法。
【背景技術】
[0002] 馬立克氏病（Marek's disease,MD)是由馬立克氏病病毒（（Marek's disease virus，MDV)引起的一種禽類高度接觸性、傳染性、淋巴組織增生性腫瘤病，主要危害雞，鶴 鶉、山雞也有發病。該病可引起內臟器官、肌肉和外周神經的淋巴細胞瘤的神經腫大。臨床 上MD發病雞群表現為生長不均勻、極度消瘦、死亡等癥狀，最常見的病變是神經損害和多種 實質臟器的淋巴腫瘤，以肝臟、脾臟腫瘤最為多見，因神經損害導致的不對稱性進行性麻 痹，最終可引起單個或多個肢體的完全性麻痹。
[0003] MDV屬于皰疹病毒科，有三種不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含 有特異性抗原。I型MDV感染能引起腫瘤，Π 型和ΙΠ 型MDV毒株無致病性，可用于疫苗株。因 I 型MDV感染可引起腫瘤，其檢測具有非常重要的意義。目前，臨床上最常用鑒別診斷I型MDV 感染的方法是病毒分離培養、血清學檢測、分子生物學方法等。病毒分離鑒定不但對臨床診 斷很有價值，對流行病學及病原學研究亦至關重要，但該方法檢測周期長，約需1~2個月， 同時細胞培養的操作要求高，局限性較大。血清學方法如ELISA等主要用于檢測羽毛囊上 皮、溶細胞感染的淋巴細胞組織及細胞培養物等樣品，此類方法檢測成本相對較高，并且由 于部分病例中病毒血癥時間較短，病毒含量低，導致檢出率較低。

【發明內容】

[0004] 有鑒于此，有必要針對現有技術中檢測馬立克氏病病毒存在的問題，提供檢測 OSTC(oligosaccharyltransferase complex subunit，0STC)基因 mRNA的可變腺苷酸位點 使用情況的引物及方法。
[0005] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0006] 一種檢測0STC基因 mRNA的可變腺苷酸位點使用情況的引物，所述引物包括第一對 引物和第二對引物，其序列與0STC基因3'非翻譯區中的兩對序列或其互補序列相同。
[0007] 優選地，所述第一對引物的序列與0STC基因3'非翻譯區中common區域的部分序列 或其互補序列相同，所述第二對引物的序列與0STC基因3'非翻譯區中Extended區域的部分 序列或其互補序列相同。
[0008] 優選地，所述第一對引物用于擴增common區域的Prox ima 1片段，所述第二對引物 用于擴增Extended區域的Distal片段。
[0009] 優選地，所述第一對引物的序列如SEQ ID N0:1-2所示或其互補序列，所述第一對 引物的序列如SEQ ID N0:3-4所示或其互補序列。
[0010 ] -種檢測0STC基因 mRNA的可變腺苷酸位點使用情況的方法，包括以下步驟：
[0011] 提取樣品總RNA，逆轉錄得到cDNA;
[0012] 以CDNA為模板，使用第一對引物qPCR擴增common區域的Proximal片段，得到CT 值pro ;
[0013] 以cDNA為模板，使用第二對引物擴增Extended區域的Distal片段，得到CT值dis;
[0014] 計算CT值dis與CT值pr。的比值。
[0015]優選地，所述qPCR的反應體系為： cDNA 模板 ΙμL， 2xqPCR Master Mix 5μ[，..
[0016] 上游引物 0.25pL， 下游引物 0.25μΕ， 無核酸酶水 至ΙΟμΙ..。
[0017] 優選地，所述qPCR的反應條件為：
[0018] 預變性:95°Clmin;擴增:95°C5s，62°C15s，72°C10s信號收集，40個循環；溶解曲 線:95°Clmin;冷卻:37°Clmin。
[0019] 3 '端非翻譯區（3 ' UTR)作為mRNA結構的一部分，對mRNA的穩定性、定位及翻譯效率 都起著重要的作用。基因最后一個外顯子上的可選擇性P〇ly(A)位點，可以導致不同長度的 3 ' UTR，即tandem 3 ' UTR(串聯3 ' UTR)。目前已有大量文獻報道在免疫應答、神經活化、腫瘤 形成及胚胎發育過程中均有3'UTR長度的改變。在基因動態的調節過程中，選擇性聚腺苷酸 化(alternative polyadenylation，APA)在近年來受到人們的廣泛關注。最近的研究表明 有超過一半的人類基因含有APA位點。這些都暗示著APA對于基因功能可能有著重要的調控 作用，也有著巨大的潛力成為新的分子標記物。隨著第二代高通量測序技術的發展，研究人 員近年來開發了多種高通量測序文庫制備方法來對全基因組APA進行測序和分析。隨著APA 研究的深入，APA越發成為新的基因轉錄與翻譯調控的研究熱點，目前，已有研究開始將APA 作為腫瘤發生的生物學標記。
[0020] 本發明利用雞的0STC基因3'非翻譯區中的兩對序列或其互補序列，通過實時熒光 定量PCR方法對雞只組織或血液中的0STC基因信使核糖核酸mRNA的可變腺苷酸位點使用情 況進行檢測，發現宿主在感染MDV后0STC基因可變腺苷酸位點的使用情況發生了明顯改變， 可將0STC基因可變腺苷酸位點的使用變化作為宿主(雞只等)感染馬立克病毒的生物學標 記。
[0021] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:本發明0STC基因 mRNA的可變腺苷酸 位點使用情況的檢測方法方便快捷，靈敏度高，特異性好，適合在條件簡陋的實驗室以及發 展中國家得到進一步推廣。
【附圖說明】
[0022]圖1為mRNA結構中qPCR引物設計位點示意圖。
[0023]圖2為實施例1中0STC基因 APA的變化情況。
【具體實施方式】
[0024]為了更好的說明本發明，下面結合附圖和【具體實施方式】做進一步說明。本發明中 所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再贅述。 [0025] 實施例1
[0026]用1 X 105pfu Md5(Marek，s disease virus Md5，MDV Md5)感染單層CEF細胞（雞 胚成纖維細胞），以不感染的CEF細胞為對照，分別收集18h、36h、54h、72h后的細胞，提取總 RNA ;消化DNA后，檢測0D260/280，比值在2.0-2 . 1為合格。對合格的總RNA進行SAPAS (sequence of alternative polyadenylation site,SAPAS)文庫的構建，構建好的文庫用 !1;[-369-2500平臺進行高通量測序，對測序結果進行4?4(31丨61'仙1:;[￥6口015^(16117131:;[011， APA)的分析。
[0027] 結果如圖2所示，對比感染Md5和不感染Md5的CEF細胞的APA分析結果，發現0STC基 因多聚腺苷酸化位點的使用情況發生了明顯改變，感染Md5的CEF細胞的LMAN2基因使用遠 端APA位點mRNA的比例提高，可作為感染MDV的一個生物標記。
[0028] 實施例2
[0029] 本實施例中檢測0STC基因 mRNA的可變腺苷酸位點使用情況的引物如表1所示。該 引