基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法。
【背景技術】
[0002]pET22b是商品化的原核表達載體，在N端融合一段疏水信號肽，能夠將目的蛋白轉運到細胞周質空間。由于大腸桿菌周質空間中的蛋白量不到胞內蛋白量的4%，分泌到周質空間，目的蛋白占的比例高，且雜蛋白少，利于目的蛋白分離純化，然而，由于此載體的蛋白表達量及從細胞周質中高效提取蛋白技術的限制致使該載體的應用較少。
【發明內容】
[0003]本發明的目的之一是以基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)為對象，建立一種抗菌蛋白高表達方法；目的之二是建立一種蔗糖和溶菌酶同時處理從細胞周質空間提取抗菌蛋白方法，目的之三是建立一種改進的HIS柱純化抗菌蛋白方法。應用本發明，抗菌蛋白表達率達34.2%,菌體破壁后的抗菌蛋白含量高、雜蛋白少，HI S柱純化后蛋白純度為電泳一條帶，蛋白含量為67.8mg/l，蛋白收率為90.8%。純化后的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、葉霉病、玉米莖基腐病、小麥赤霉病菌和水稻稻曲病菌生長功能。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0005]—種基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法，具體實施步驟如下:
[0006]—、抗菌蛋白表達
[0007]取-70°C冷凍保藏的基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)劃線接種于含氨芐青霉素的LB固體平板上，37°C溫箱培養18h，挑較大菌落轉接于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養液中(氨芐青霉素濃度為SOyg/ml)，37°C，170r/min震蕩培養18h，然后按2 %接種量接種到新鮮10ml含氨芐青霉素的LB液體培養基中(氨芐青霉素濃度為50yg/ml)，30°C170r/min震蕩培養至0D_ = 1.2-1.8,加入IPTG至0.05-0.1mM，15_20°C震蕩培養4h。
[0008]二、抗菌蛋白提取
[0009]取10ml誘導表達后的菌液4°C5000r/min離心lOmin，收集菌體，加入1ml蛋白提取液(20mMTris.Cl,2.0mMEDTA，20 % 蔗糖，溶菌酶 50mg/L，pH8.0)，室溫 5min，10000r/min 離心1min，收集沉淀，懸浮于2ml (20mM Tris.Cl，2.0mMEDTA，pH8.0)緩沖液中，即得抗菌蛋白提取液。
[0010]三、抗菌蛋白純化
[0011 ]取Iml N1-His.Bind懸液至于5ml離心管中，10000!'/111；[11離心1111；[11，用1.5-2.0ml無菌去離子水洗滌2次，加入1.5-2.0ml結合緩沖液平衡His柱，加入0.5_lml蛋白提取液充分混合，室溫5-10min，10000rpm/min離心2min，棄上清，用3-4ml結合緩沖液洗滌4次，用3-4ml漂洗緩沖液洗滌4次，每次洗滌后用濾紙吸干殘液，去除雜蛋白，用0.5-lml洗脫液洗脫目的蛋白2次，即得純化后的抗菌蛋白。
[0012]本發明利用pET22b表達載體和宿主菌E.coli BL21獲得的含抗菌蛋白TasA基因的工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)，通過改變培養和誘導條件建立一種高表達抗菌蛋白的IPTG低溫誘導方法，采用蔗糖和溶菌酶處理建立從細胞周質空間提取抗菌蛋白方法，采用改進的HIS柱純化技術分離純化抗菌蛋白。本發明具有如下優點:
[0013]1、本發明建立了基于pET22b表達載體的基因工程菌高表達抗菌蛋白的誘導方法，該方法與現有方法有顯著區別，即在菌體密度較高時(OD6qq = 1.2-1.8)加入低濃度IPTG(0.05-0.1mM)在低溫條件(15_20°C)下誘導4_6h，蛋白表達率為34.2%；
[0014]2、本發明建立了蔗糖和溶菌酶同時處理的從細胞周質空間提取目的蛋白方法，該方法提取的目的蛋白含量高、雜蛋白量少，利于目的蛋白純化；
[0015]3、本發明建立了小量抗菌蛋白純化技術，操作過程加以改進，增加洗脫體積和次數，使分離純化的抗菌蛋白純度較高，為電泳一條帶，純化蛋白收率和蛋白含量較高，分別為90.8 %和67.8mg/l。純化后的抗菌蛋白能夠抑制5種植物病原真菌菌絲生長。
[0016]4、本發明獲得的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、葉霉病、玉米莖基腐病、小麥赤霉病菌和水稻稻曲病菌生長功能。
【附圖說明】
[0017]圖1為基因工程菌株誘導表達后的SDS-PAGE結果，1:誘導后的蛋白樣品；2:未誘導蛋白樣品;M:蛋白質分子量標準，—為表達蛋白；
[0018]圖2為不同IPTG濃度誘導后的SDS-PAGE結果，M:蛋白質分子量標準；1:未誘導；2:1PTG 濃度 0.1mM； 3:1PTG 濃度 0.5mM；4: IPTG 濃度 0.05mM；
[0019]圖3為不同溫度誘導后的SDS-PAGE電泳圖，M:蛋白質分子量標準；1:未誘導；2:20°C；3:15°C；
[0020]圖4為不同方法提取蛋白的SDS-PAGE結果，I:蔗糖加溶菌酶處理;2、3:未誘導熱處理;4:誘導后熱處理；
[0021 ]圖5為純化蛋白SDS-PAGE結果，1:未誘導；2:誘導后未純化;3: HIS柱純化;M:蛋白分子量標準；
[0022]圖6為純化蛋白抑菌效果(玉米莖基腐病菌)；
[0023]圖7為純化蛋白抑菌效果(水稻稻曲病菌)；
[0024]圖8為純化蛋白抑菌效果(番茄灰霉病菌)；
[0025]圖9為純化蛋白抑菌效果(番茄葉霉病菌)；
[0026]圖10為純化蛋白抑菌效果(小麥赤霉病菌)。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發明的保護范圍中。
[0028]【具體實施方式】一:本實施方式提供了一種基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達方法，具體實施步驟如下:
[0029]1、抗菌蛋白基因的表達
[0030]取-70°C冷凍保藏的基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)劃線接種于含氨芐青霉素的LB固體平板上，37°C溫箱培養18h，挑較大菌落轉接于5ml LB液體培養液中(含氨芐青霉素濃度為50噸/1111)，371，17(^/1^11震蕩培養1811，然后按2%接種量接種到新鮮100ml LB液體培養基中(含氨芐青霉素濃度為50yg/ml)，30°C170r/min震蕩培養至OD600 =1.2-1.8,加入 IPTG 至 0.2mM，30°C 震蕩培養 4h，取 Iml 菌液 4°C5000r/min 離心 1min，收集菌體，加入2(^1無菌水和蛋白上樣緩沖液，100°(310111；[11，4°(3100001'/111；[11離心10111；[11，取上清液進行SDS-PAGE電泳，結果在32kD左右有一條明顯蛋白帶，含量為15.6%。(圖1)。
[0031]2、抗菌蛋白基因表達條件的優化
[0032]2.1IPTG濃度的優化
[0033]按上述方法活化菌體，按2%接種量接種到新鮮100mlLB液體培養基中(含氨芐濃度為50yg/m)，30°C170r/min震蕩培養至OD6QQ= 1.2-1.8，加入IPTG至0.05,0.1mM和0.5mM，30°C震蕩培養4h，取Iml菌液按上述方法制備蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，結果在32kD左右有一條明顯蛋白帶，IPTG濃度對目的蛋白含量有影響，低濃度IPTG(0.05和0.1mM)處理組目的蛋白條帶粗且量，表達率高，分別為18.9 %和17.4 %，高濃度IPTG處理組目的蛋白表達率低，為9.8%(圖2)。
[0034]2.2誘導溫度的優化
[0035]按上述方法活化菌體，按2%接種量接種到新鮮100mlLB液體培養基中(含氨芐濃度為50yg/ml)，30°C170r/min震蕩培養至OD6QQ