一種頭狀鏈霉菌發酵生產絲裂霉素的新型培養基和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于發酵技術領域，特別是涉及一種頭狀鏈霉菌發酵生產絲裂霉素的新型培養基和培養方法。
【背景技術】
[0002] 絲裂霉素(Mitomycin)是一種廣譜抗腫瘤抗生素，自1956年Hata第一個從頭狀鏈霉菌的培養液中分離到絲裂霉素開始，由于它特殊的抗腫瘤作用引起人們廣泛的關注。
[0003]目前，國內絲裂霉素的發酵生產采用二發酵模式，存在的主要問題有以下幾點:
[0004]1絲裂霉素發酵水平較低，一般控制在800u/ml左右。
[0005]2國內外針對絲裂霉素的生產工藝文獻資料報道得較少。
[0006]3發酵生產絲裂霉素的培養基中加入葡萄糖，經高溫滅菌，易導致部分葡萄糖碳化，降低總糖含量，影響發酵液質量。
【發明內容】
[0007]本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種發酵工藝簡單，有效提高發酵單位，同時最大限度的降低原輔料對發酵單位的影響，降低生產成本，且原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現絲裂霉素穩定、高效生產的頭狀鏈霉菌發酵生產絲裂霉素的培養基。
[0008]本發明的另一目的是提供利用上述培養基生產絲裂霉素的培養方法。
[0009]為實現上述目的所采取的技術方案為:
[〇〇1〇]—種頭狀鏈霉菌發酵生產絲裂霉素的培養基，包括種子培養基和發酵培養基，其特征在于
[0011]所述種子培養基的組成為:甘露醇4?8g/L、甘蔗糖蜜8?12g/L、麥芽糖5?9g/L、麥芽糖酶〇.02?0.06g/L、蠶蛹粉4?8g/L、玉米漿10?14ml/L、玉米蛋白粉3?7g/L、硫酸銨3?7g/L、輕質碳酸|丐1?5g/L;
[0012]所述發酵培養基組成為:甘露醇4?8g/L、甘蔗糖蜜11?15g/L、麥芽糖9?13g/L、麥芽糖酶0.04?0.08g/L、蠶蛹粉6?10g/L、玉米漿15?19ml/L、玉米蛋白粉5?9g/L、硫酸銨4?8g/L、輕質碳酸|丐3?7g/L、磷酸鎂0.2?0.6g/L、氯化鈉0.3?0.7g/L、硫酸亞鐵0.01?0.05g/L、聚醚改性硅油0.03?0.07ml/L、維生素B6 0.05?0.09g/L、泛酸0.01?0.05g/L、氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯0.5?lg/L。
[0013]—種利用上述培養基生產絲裂霉素的培養方法，其特征在于所述工藝步驟為:
[〇〇14]1)種子培養:首先將種子培養基滅菌并冷卻至25?30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的頭狀鏈霉菌母瓶發酵液按照〇.5?0.9L/m3的接種量接入該種子培養基中進行種子培養，至菌體濃度35?40%、pH值6?7、培養時間40?50h時移種；[〇〇15]2)發酵培養:先將發酵培養基滅菌，冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養，移種比例控制在9?11 %，至菌體濃度35?40 %、還原糖<2.0g/L、氨基氮< 15mg/l00ml、化學效價> 1300u/mL、pH6.0?7.5、培養時間200?220h時終止發酵。
[〇〇16] 滅菌后的種子培養基的質量要求:氨基氮40?60mg/100ml、還原糖50?70g/L、pH:6.5?7.5;
[0017]滅菌后的發酵培養基的質量要求:氨基氮70?80mg/100ml、還原糖70?90g/L、pH:
6?7〇
[0018]所述培養好的母瓶發酵液質量要求為:PH6?8;菌體濃度10?20% ;鏡檢無雜菌；搖瓶發酵單位800?1000u/ml。
[〇〇19] 所述種子培養條件為:罐壓0.03?0.05MPa;罐溫28?29°C;空氣流量:0?10h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；1 lh?移種:30?50m3/h;攪拌轉速70?80r/min。
[0020]所述發酵培養條件為:
[0021] a溫度:采用變溫控制方法，0?60h:培養溫度29?30°C;61?170h:培養溫度28?29°C; 171?發酵培養結束，培養溫度26?27°C;
[0022] b攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，0?60h:轉速控制在90r/min; 61?170h:轉速控制在120r/min; 171h?發酵結束:轉速控制在80r/min;
[0023] c壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa;
[0024]d pH控制:發酵過程中pH控制在6?7;
[0025] e 空氣流量:0 ?60h: 150 ?200m3/h; 61 ?170h: 250 ?300m3/h; 171h?發酵結束:100?150m3/h;
[0026] f溶氧控制:
[〇〇27]發酵前60h內，不控制溶氧；
[0028] 61?170h，溶氧控制在30%以上；
[〇〇29] 171?發酵結束:溶氧控制在40%以上。
[0030]在發酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補蛋白胨、補水、補糖和pH控制，其中
[0031 ] a補蛋白胨工藝控制:
[〇〇32]發酵前60h不用進行補油，
[〇〇33]發酵時間在61?170h，當氨基氮含量低于40mg/100ml，補入蛋白胨，控制氨基氮為40?60mg/100ml，每隔6?8h檢測發酵液氨基氮含量，
[〇〇34]發酵時間在171?200h，當氨基氮含量低于20mg/100ml，補入蛋白胨，控制氨基氮含量為20?40mg/100ml，每隔6?8h檢測發酵液氨基氮含量，
[〇〇35]發酵時間在201h?發酵結束，當氨基氮含量低于10mg/100ml，補入蛋白胨，控制氨基氮含量為10?15mg/100ml，每隔6?8h檢測發酵液氨基氮含量；
[〇〇36] b補水工藝控制:
[〇〇37]發酵前60h不用進行補水，
[〇〇38]發酵時間在61?120h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在40?45 %，每隔6?8h檢測發酵液菌體濃度，
[〇〇39]發酵時間在121?200h，當菌體濃度高于40 %，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在35?40 %，每隔6?8h檢測發酵液菌體濃度，
[0040]發酵時間在201h?發酵結束，當菌體濃度高于35%，加入滅菌水，要求控制發酵液菌體濃度在30?35 %，每隔6?8h檢測發酵液菌體濃度；
[0041 ]c補入麥芽糖控制:
[〇〇42]發酵前60h，還原糖含量不進行控制，
[〇〇43]發酵61h至120h:還原糖含量<50g/L時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在50?55g/L，
[0044]發酵121h至200h:還原糖含量<30g/L時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在30?35g/L，
[0045]發酵201h至發酵結束:還原糖含量<5g/L時，補入已滅菌的麥芽糖溶液，使還原糖的含量控制在5?10g/L。
[0046]上述麥芽糖溶液中加入麥芽糖酶，其濃度控制在0.001?0.003%。
[0047]本發明的技術優勢體現在:
[0048]1本發明確認了種子培養基、發酵培養碳源、氮源和最佳配伍比例。
[0049]2本發明對種子培養、發酵培養的工藝進行了詳細的闡述，確認了絲裂霉素最佳的發酵工藝和控制參數。達到的技術效果為發酵單位在1300u/ml以上。
[0050]3采用麥芽糖代替葡萄糖，經高溫滅菌后，不影響培養基質量。
[0051]4本發明適用于企業規模化發酵生產絲裂霉素，能夠滿足年產100kg絲裂霉素生產需求。
[〇〇52]具體實施方法
[〇〇53]下面用實例予以說明本發明，應該理解的是，實例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。本發明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。
[〇〇54]下述實施例的菌種選用頭狀鏈霉菌:母瓶發酵液質量要求為:pH6?8;菌體濃度10?20% ;鏡檢無雜菌;搖瓶發酵單位800?1000u/ml。
[0055]實施例1
[〇〇56]種子培養:種子罐有效體積為lm3。
[0057]種子培養基的組成為:甘露醇4kg、甘蔗糖蜜8kg、麥芽糖5kg、麥芽糖酶0.02kg、蠶蛹粉4kg、玉米漿10L、玉米蛋白粉3kg、硫酸銨3kg、輕質碳酸鈣lkg。滅菌后的種子培養基的質量:氨基氮42/10〇1111、還原糖5]^凡4!1:7.4。
[〇〇58]將種子培養基滅菌并冷卻至25?30°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的頭狀鏈霉菌母瓶發酵液按照0.5L/m3的接種量接入該種子培養基中進行種子培養。
[〇〇59]種子培養條件為:罐壓0.03?0.05MPa;罐溫28?29°C;空氣流量:0?10h，采用空氣攪拌代替機械攪拌；llh?移種:30m3/h;攪拌轉速70r/min。至菌體濃度35%、pH6.8、培養時間40h時移種。
[0060]發酵培養:發酵罐有效體積為10m3。
[〇〇611發酵培養基組成為:甘露醇40kg、甘蔗糖蜜110kg、麥芽糖90kg、麥芽糖酶0.4kg、蠶蛹粉60kg、玉米衆150L、玉米蛋白粉50kg、硫酸銨40kg、輕質碳酸|i530kg、磷酸鎂2kg、氯化鈉3kg、硫酸亞鐵0.lkg、聚醚改性硅油0.3L、維生素B6 0.5kg、泛酸0.1kg、氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯5kg。先將發酵培養基滅菌，滅菌后的發酵培養基的質量:氨基氮70mg/100ml、還原糖71g/L、pH: 6.9。發酵培養基冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養，移種比例控制在9%。
[〇〇62]發酵培養條件為:
[〇〇63] a溫度:采用變溫控制方法，0?60h:培養溫度29?30°C;61?170h:培養溫度28?29°C; 171?發酵培養結束，培養溫度26?27°C。
[〇〇64] b攪拌轉速:采用變頻攪拌控制方法，0?60h:轉速控制在90r/min; 61?170h:轉速