anKW，ChenF，JonesEBG，et al .Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids production by and okara- utilizing potential of thraustochytrids[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001,27(4): 199-202.)，Quilodran嘗試破囊壺菌以土豆加工廢渣為 碳源所得DHA產量55· lmg/L/d(Quilodr&n B，Hinzpeter I，Quiroz A,et al .Evaluation of liquid residues from beer and potato processing for the production of docosahexaenoic acid(C22:6n_3，DHA)by native thraustochytrid strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(12):2121_2128.)〇
[0033] 在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述丙氨酸母液被稀釋為在所述發酵 培養基中丙氨酸的終濃度為〇. 132~26.4g/L，更優選的是0.5~1.5g/L，最優選的是0.88g/ L〇
[0034] 由于丙氨酸母液的營養成分較為單一，而且其中某些產物等對菌體生長極為不 易，所以直接從平板挑單菌落至以丙氨酸母液為氮源的發酵培養基中，菌體無法大量繁殖， 為使菌體大量繁殖并獲得較高的DHA產量，在本發明的其中一些實施例中，作為優選，所述 發酵培養基中還包括輔助因子，所述輔助因子選自酵母粉、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨和無 機微量元素中的任意一種。
[0035]在上述方案中，作為優選，所述輔助因子為所述酵母粉。
[0036]在本發明的其中一些實施例中，作為優選，所述發酵培養基中所述酵母粉的濃度 為0.1~2g/L，更優選的是，所述酵母粉的濃度為0.2~0.7g/L，最優選的是，所述酵母粉的 濃度為〇.4g/L。
[0037] 在本發明的其中一些實施例中，作為優選，所述大豆蛋白胨的濃度為0.1~2g/L， 更優選的是，所述大豆蛋白胨的濃度為〇.2g/L;所述牛肉膏蛋白胨的濃度為0.1~2g/L，更 優選〇.2g/L;所述無機微量元素的濃度為0.05~10mg/L，更優選的是5mg/L。該無機微量元 素中包含有Na，Cu，Mn，Zn，Mo，Mn，S和P等元素。
[0038] 在上述方案中，作為優選，所述的用于生產DHA的發酵培養基中還含有濃度為40g/ L~120g/L的葡萄糖和質量百分比為20%的無機鹽。最優選的，葡萄糖的濃度為80g/L。更優 選地，無機鹽選用海水晶。
[0039]本發明還提供一種生產DHA的方法，在上述任一所述的發酵培養基中接種能合成 DHA的微生物進行培養，生產DHA。
[0040]因為DHA為胞內油脂，提高生物量可以獲得更高的DHA產量，所以在本發明的其中 一個實施例中，作為優選，所述能合成DHA的微生物為裂殖壺菌或破囊壺菌，所述裂殖壺菌 或破囊壺菌在所述發酵培養基中的接種量為10%~20%。更優選的是，最佳的接種量14%。 且于溫度26°C下培養3天。
[0041 ] 實施例1
[0042] 本發明中利用的丙氨酸母液由安徽華恒生物工程有限公司提供，丙氨酸母液中的 丙氨酸濃度為132g/L。
[0043] 本發明公開了一種利用丙氨酸母液代替傳統氮源發酵生產DHA的方法。該方法包 括以下步驟：（1)將丙氨酸母液稀釋至一定濃度配制發酵培養基；（2)發酵培養基中添加一 定量的酵母粉用作輔助因子促進丙氨酸的利用；（3)配制好的發酵培養基接種一定量的菌 種用于DHA的發酵生產。
[0044] 本發明可以利用工業生產丙氨酸的母液代替傳統發酵過程中使用的氮源，不僅可 以解決丙氨酸母液難以處理的問題，而且大大減少了 DHA發酵生產的成本。
[0045]本發明的目的在于提供一種利用丙氨酸母液生產DHA的方法。本發明對發酵過程 中的輔助因子的來源及用量、氮源的添加量以及菌株接種量都進行了研究，以獲得能夠產 生大量DHA的各個參數的合適范圍。
[0046]由于丙氨酸母液的營養成分較為單一，而且母液中所包含的有機酸和美拉德反應 的產物等對菌體生長極為不利，所以直接從平板挑單菌落至以丙氨酸母液為單一氮源的發 酵培養基中，菌體無法大量繁殖，所以擬添加適宜的輔助因子，然后確定最優輔助因子的最 適添加量。發酵過程中最主要的營養成分為碳源和氮源，擬確定葡萄糖和丙氨酸母液的最 適添加量，以獲得最高產量的DHA。因為DHA為胞內油脂，提高生物量可以獲得更高的DHA產 量，所以擬確定最佳的接種量以提高生物量。
[0047] 利用丙氨酸母液發酵生產DHA，具體的工藝步驟為：
[0048] 1)丙氨酸母液的稀釋以及最適碳源氮源濃度的確定
[0049]丙氨酸母液中的丙氨酸濃度為132g/L，在菌體進入油脂積累階段后，過高的氮源 濃度會抑制油脂的積累，所以需要對母液進行稀釋，以DHA產量為標準確定氮源的最適添加 量，同時確定氮源的最適添加量以獲得較高的DHA產量。
[0050] 2)確定最優的輔助因子來源及最適添加濃度
[0051] 分別嘗試了菌體在微生物源的酵母粉、植物源的大豆蛋白胨、動物源的牛肉膏蛋 白胨、添加無機微量元素的丙氨酸母液、單一的無機氮源尿素中的生長情況，以確定最佳的 輔助因子。然后依據DHA的產量，確定該輔助因子的最適添加量。
[0052] 3)最適接種量的確定
[0053] DHA為胞內油脂，所以獲得更高的生物量便可以得到更高產量的DHA。因為丙氨酸 母液中含有大量的有機酸、色素等不利于菌體正常生長代謝的成分，所以不利于菌體的大 量積累，從而影響DHA的產量。最簡單經濟的提高生物量的方式是加大接種量，所以以DHA產 量為標準確定最適的接種量。
[0054] 利用本發明的方法，將丙氨酸母液作為唯一氮源，代替傳統的氮源生產DHA，可以 將丙氨酸母液中的丙氨酸安全利用，不僅解決了丙氨酸生產公司處理丙氨酸母液的難題， 而且大大降低了DHA的生產成本，最終DHA產量可以達到3.86g/L，遠高于Fan嘗試裂殖壺菌 以豆渣為底物所得DHA產量35.3~72.1mg/L(Fan K W，Chen F，Jones E B G，et al .Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids production by and okara- utilizing potential of thraustochytrids[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001,27(4): 199-202.)，Quilodran嘗試破囊壺菌以土豆加工廢渣為 碳源所得DHA產量55· lmg/L/d(Quilodr&n B，Hinzpeter I，Quiroz A,et al .Evaluation of liquid residues from beer and potato processing for the production of docosahexaenoic acid(C22:6n_3，DHA)by native thraustochytrid strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(12):2121_2128.)〇
[0055] -、碳源和氮源的最適添加量
[0056] 碳源和氮源是裂殖壺菌正常生長代謝過程中最重要的營養物質。在菌體生長階 段，充足的氮源有利于菌體的大量繁殖。但是進入油脂積累階段，過剩的氮源會阻礙油脂的 積累。所以適宜的氮源濃度有利于獲得更高的DHA產量。因為丙氨酸母液中的丙氨酸濃度為 132g/L，所以對丙氨酸母液進行稀釋。
[0057] 取裂殖壺菌或破囊壺菌按照10%的接種量接種于含有不同濃度葡萄糖