乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導入植物細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物活性分子技術領域，涉及一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導入植物細胞的方法。
【背景技術】
[0002]生物活性分子導入技術在將酸性生物活性分子導入植物細胞這一方面，仍受到高效性、經濟性和操作簡易性等方面的限制，仍是對更廣泛的植物物種進行活體細胞實時檢測技術的瓶頸之一。相關研究曾報道，研究人員利用多孔硅納米顆粒等材料將DNA分子導入植物原生質體中。然而，制備原生質體時，不僅操作繁瑣、得率較低，得到的原生質體非常脆弱，極易破裂。因此，研究者們一直在探索一種能夠將生物活性分子直接導入完整活體植物細胞的理想載體。
[0003]作為一種新型的生物活性分子載體，無機納米材料正以其操作簡單，適用廣泛等優勢受到研究者們的重視。其中，類水滑石納米片(layered double hydroxide，LDH)相對于其他納米材料而言，具有合成方法簡單，原材料容易獲得的優勢。特別是還能通過對其片層結構表面進行功能基團的特異性修飾，進一步開發其應用潛力。
[0004]因此，本研究首次借助無機納米材料乳酸根插層的類水滑石開發了一種將生物活性分子導入完整活體植物細胞的技術，這不僅能為基礎生物學研究提供有力的工具，也將在多種作物和林業經濟樹種的基因改造和遺傳育種方面具有重大意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導入植物細胞的方法，解決了現有技術難以將生物活性分子導入完整活體植物細胞中的問題。
[0006]本發明所采用的技術方案是，一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導入植物細胞的方法，按照以下步驟進行:
[0007]步驟1，合成乳酸根插層的類水滑石納米材料MgAl-lactateLDH，在水中剝離獲得二維納米片LDH-lactate-NS;
[0008]步驟2，對LDH-lactate-NS進行XRD等表征分析鑒定；
[0009]步驟3，用含有不同濃度LDH-lactate-NS的緩沖液處理BY-2細胞和擬南芥，獲得其負載生物活性分子導入植物細胞的安全濃度；
[0010]步驟4，將生物活性分子和LDH-lactate-NS以不同的質量比進行偶聯；
[0011 ]步驟5，將二維納米片-生物活性分子復合物與植物細胞共孵育，把生物活性分子導入植物細胞中。
[0012]進一步的，所述步驟1具體按照以下步驟進行:將鎂/鋁摩爾比為0.5:1-6:1的鎂鋁乳酸鹽于125mL雙蒸水中在30-100°C條件下溶解配制成溶液A置于分液漏斗中；另將大于等于鋁的摩爾量的L-乳酸溶于25mL雙蒸水中，配制成溶液B置于三頸圓底燒瓶中；在室溫下快速攪拌將溶液A逐滴滴入溶液B中，滴定過程中用氫氧化鈉溶液控制其pH體系，維持pH值為8-12；待滴定完畢后，繼續劇烈攪拌并陳化5-48h，得到乳白色混合物，用雙蒸水通過離心方法反復洗滌直至上清液變渾濁；將離心后的樣品分為兩份，一份置于真空干燥箱里室溫干燥，干燥后研磨，所得粉末為MgAl-lactate LDH;另一份置于一定量的雙蒸水中，劇烈攪拌直至沒有沉淀變為透明狀得到懸濁液C，懸濁液C的濃度由干燥后MgAl-lactate LDH質量和雙蒸水的含量計算得出，記為LDH-lactate-NS，全過程在N2保護下進行。
[0013]進一步的，所述步驟2具體按照以下步驟進行:將剝離的LDH-lactate-NS滴在銅網上進行TEM(透射電子顯微鏡)成像，并烘干LDH-lactate-NS進行SEM(掃描電子顯微鏡)成像，采用凝膠法將LDH-lactate-NS置于托盤獲得XRD特征譜，并用激光照射LDH-lactate-NS膠體檢測丁達爾現象。
[00M] 進一步的，所述步驟4中，LDH-lactate-NS:帶負電荷的生物活性分子DNA(脫氧核糖核酸)質量比為3:1時，LDH-lactate-NS:帶負電荷的生物活性分子FITC(異硫氰酸熒光素)質量比為5:1時，可完全吸附。
[0015]進一步的，所述步驟5具體按照以下步驟進行:將LDH-lactate-NS的濃度控制在100ug/ml以下作為工作濃度，以DNA: LDH-lactate-NS質量比1: 3以上，以FITC:LDH-lactate-NS質量比1:5以上，孵育時間為lh，即將生物活性分子導入植物細胞中。
[0016]本發明的有益效果是:首次使用水中剝離的二維納米片(LDH-lactate-NS)通過偶聯生物活性分子獲得納米片-生物活性分子復合物，以最優吸附比和孵育時間與植物細胞共孵育將生物活性分子導入完整的活體植物細胞中。(1)在水中剝離獲得了LDH-lactate-NS 二維納米片 ，保證了溶劑對細胞無毒， 克服了現有的生物活性分子載體只能溶于 DMS0/甲醇等有毒溶劑中；(2)通過試驗探索，利用LDH-lactate-NS二維納米片吸附生物活性分子的特性，彌補了現有的生物活性分子載體吸附生物活性分子時間較長的缺點，大大縮短了試驗時間，為活體實時檢測提供了更加便利和快捷的方法；(3)通過優化對生物活性分子的負載和導入生物活性分子至活體細胞的條件，可以借助LDH-lactate-NS 二維納米片高效吸附生物活性分子并有效導入完整活體植物細胞中，超越了現有生物活性分子載體的功能極限。
【附圖說明】
[0017]圖1 是LDH-lactate-NS表征:其中，ASLDH-lactate-NS的XRD表征；B為LDH-lactate-NS 的 FE-SEM 表征；C為LDH-lactate-NS 的丁達爾現象；D為LDH-lactate-NS 的 HR-TEM表征。
[0018]圖2是PI染色不同濃度LDH-lactate-NS處理的BY-2細胞:其中，A_C為PI染色25yg/ml LDH-lactate-NS處理的BY-2細胞;D-F為PI染色50yg/ml LDH-lactate-NS處理的BY-2細胞;G-1為PI染色 100yg/ml LDH-lactate-NS處理的BY-2細胞;J-L為PI染色300yg/ml LDH-lactate-NS處理的BY-2細胞。標尺長度為ΙΟΟμπι。
[0019]圖3是含不同濃度LDH-lactate-NS培養基上的幼苗根長、胚軸長度:其中，A為擬南芥幼苗的根長;B為擬南芥幼苗的胚軸長度。**表示P < 0.01，***表示P <0.001o
[0020]圖4是LDH-lactate-NS對DNA分子的吸附能力。[0021 ]圖 5是 Zeta-potential 數據。
[0022]圖6是LDH-lactate-NS負載FITC導入BY-2細胞:A為明場;B為熒光圖；C為高倍鏡下的DIC圖；D為高倍鏡下的熒光圖；E為C和D的疊加圖。標尺長度分別為100μπι(Α和B)和20μπι(C、D和Ε)。
[0023]圖7是LDH-lactate-NS負載ssDNA-FITC導入BY-2細胞:A為背景熒光圖；B為LDH-lactate-NS負載ssDNA-FITC導入BY-2細胞后的熒光圖；C為對A圖熒光場的三維成像;D為對B圖熒光場的三維成像;E為A和B圖熒光場的灰度值;F為對應B圖細胞的明場。標尺長度為30
μ??ο
[0024]圖8是LDH-lactate-NS負載FITC導入擬南芥細胞，標尺長度為30μπι。
[0025]圖9是LDH-lactate-NS負載ssDNA-FITC導入擬南芥細胞，標尺長度為30μπι。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0027]本發明一種乳酸根插層的類水滑石超薄納米片負載生物活性分子導入植物細胞的方法，按照以下步驟進行:
[0028]步驟1，合成乳酸根插層的類水滑石(MgAl-lactateLDH)納米材料，在水中剝離獲得二維納米片(LDH-lactate-NS):
[0029]將鎂/鋁摩爾比為0.5:1-6:1的鎂鋁乳酸鹽于125mL雙蒸水中在30_100°C條件下溶解配制成溶液A置于分液漏斗中；另將大于等于鋁的摩爾量的L-乳酸溶于25mL雙蒸水中，配制成溶液B置于三口圓底燒瓶中；在室溫下快速攪拌將溶液A逐滴滴入溶液B中，滴定過程中用氫氧化鈉溶液控制其pH體系，維持pH值為8-12;待滴定完畢后，繼續劇烈攪拌并陳化5-48h，得到乳白色混合物，用雙蒸水通過離心方法反復洗滌直至上清液變渾濁;將離心后的樣品分為兩份，一份置于真空干燥箱里室溫干燥，干燥后研磨，所得粉末為MgAl-lactateLDH;另一份置于一定量的雙蒸水中，劇烈攪拌直至沒有沉淀變為透明狀得到懸濁液C，懸濁液