一種嵌合核酸分子及其在人源化抗體制備中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，主要涉及一種核酸分子及其在人源化抗體制備中的應 用。
【背景技術】
[0002] 抗體是一類重要的生物醫藥制品，在人類疾病的預防和治療過程中發揮了重要的 作用。治療性抗體的發展經歷了鼠源抗體、嵌合抗體、改型抗體、表面重塑抗體和全人源化 抗體等不同的發展階段。
[0003] 全人源化抗體(Full Humanized Antibody)，是指經過基因改造或轉基因動物免 疫而獲得的與人源抗體蛋白質序列完全一致的抗體。全人源化抗體由于不含動物蛋白，因 此副作用較低，作用效果更好，已成為當前和未來抗體工程的主要研究和發展方向。目前全 人源化抗體主要由噬菌體展示技術和轉基因動物技術生產而來。2002年，第一個由噬菌體 展示技術生產的全人源化抗體Adalimumab(Humira)上市。2006年，第一個由轉基因動物來 源的全人源化抗體Panitumumab在美國和歐洲批準上市。
[0004] 菌體展示抗體(Phage Display-generating Antibody)技術生產全人源化抗體 相對簡單，技術相對成熟，但受抗體庫容量和抗體翻譯后修飾及有效折疊的影響，利用該技 術獲得高親合力抗體的難度很大。
[0005] 轉基因動物全人源化抗體(Transgenic Humanized Antibody)是指將人類免疫球 蛋白基因全部或部分通過轉基因或轉人工染色體技術，轉移至動物基因組中[動物內源的 抗體基因缺失(或失活）]，使動物表達人類抗體，從而獲得全人源化抗體。利用轉基因動物 生產全人源化抗體的最大優勢是獲得高親合力抗體的機率較大，同時利用一種轉基因動物 品系可針對不同的抗原生產不同類型的抗體，無需像噬菌體展示技術，針對不同的抗原，每 次都要重新構建噬菌體庫。但隨著研究的深入，發現轉入的人類免疫球蛋白基因片段雖然 能在動物體內重排和表達，但其產生人抗體蛋白的性能要低于未經基因改造前的動物自身 抗體生產效果。以小鼠為例，其原因主要是當抗體在B細胞發育的初級階段作為B細胞表面 受體(BCR)時，其與鼠源的信號蛋白Iga和IgP的相互作用并不是最優的（即鼠源BCR與鼠源 的I ga和IgP或人BCR與人的Iga和I 相互作用效果是最好的），因此影響了抗體的類型轉 換、親和力成熟和B細胞發育為成熟的生產抗體的漿細胞。為克服這一難題，Lee等(Nature biotechnology，2014;32(4) :356-363)將三個人免疫球蛋白基因（IgH，IgK和IgA)的可變區 替代小鼠的免疫球蛋白可變區，而恒定區使用小鼠免疫球蛋白的相應片段，利用這種策略 可克服上述提到的問題，獲得可變區為人源，恒定區為鼠源的嵌合抗體，再通過下游的改造 將鼠源的恒定區改造為人源的恒定區，得到全人源化抗體。這種方法存在的缺點是需要進 行二次改造才能獲得全人源化抗體。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種核酸分子，可以高效的制備全人源化抗體，其克服了 不同物種BCR與Iga和Ig0相互作用的不兼容性問題，同時相對Lee的方法，其表達的人源化 抗體無需進行二次改造。
[0007] 本發明的目的是通過以下措施實現的：
[0008] 本發明提供了一種核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，以及宿主動物 IgM恒定區的基因片段(即IgH Cy的基因片段）。
[0009] 優選的，上述宿主動物IgM恒定區的基因片段位于（替代)人免疫球蛋白IgM重鏈基 因的相應恒定區。
[0010] 上述宿主IgM恒定區基因片段為宿主動物IgH Cy的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和 TM2序列以及其之間的序列和相關PolyA信號序列。人CH1序列與人Ig輕鏈結合，保證抗體結 構，CH2部分區又保證人和小鼠 C區正常轉錄和翻譯。當宿主為鼠時，用于取代的鼠 IgM恒定 區基因片段如SEQ ID NO.1的〈1>~〈4425〉所示;被鼠源IgM恒定區基因片段替代的hlg序列 如SEQ ID N0.2所示。當宿主為豬時，用于取代的豬IgM恒定區基因片段如SEQ ID N0.3的〈1 >~〈4386>所示，被豬源IgM恒定區基因片段替代的hlg序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]上述核酸分子中宿主動物IgM恒定區的基因片段的結構及其與人免疫球蛋白IgM 基因或其片段的連接結構如圖1-1所示。進一步地，上述核酸分子還可以包括FRT序列、人Ig 內含子序列（如hIgM、hIgD);所述核酸分子中宿主動物IgM恒定區的基因片段與人免疫球蛋 白IgM基因或其片段，以及與FRT、人Ig內含子(如IgM、IgD)的連接結構如圖1-2所示。當宿主 為鼠時，所述FRT序列如SEQ ID N0.1〈4426>~〈4459〉，人Ig內含子序列包括SEQ ID N0.1〈 4460〉~〈4717〉；當宿主為豬時，FRT序列如SEQ ID NO. 3〈4387>~〈4420〉，人Ig內含子序列 包括SEQ ID Ν0·3〈4421>~〈4678〉。
[0012] 例如，具體地，人IgM的CH1和部分CH2序列，小鼠的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和 TM2序列以及其之間的序列和相關PolyA信號序列，與FRT、IgD內含子、人的IgHG3的調控區 (Sy3)和IgHG3CHl序列依次鏈接，形成一個表達嵌合人小鼠 IgM和人IgG的基因載體(如圖 1-3)。或者，人IgM的CH1和部分CH2序列，小鼠的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和TM2序列以及 其之間的序列和相關PolyA信號序列，與FRT、IgM內含子、人的IgD3的調控區（SS3)和IgD3 CH1序列鏈接，形成一個表達嵌合人小鼠 IgM和人IgD的基因載體(圖1-4)。
[0013] 上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重鏈基因的V區基因、D區基因、J區基 因。上述人免疫球蛋白重鏈基因還可以包括hCy、hCa、hCS和/或hC|重鏈基因和人的3'-調 控區(hLCR)等。
[0014]例如，上述核酸分子的基因簇如圖2所示（黑框位置為導入的宿主動物的IgM恒定 區基因部分序列(片段)）。
[0015] 通過以上的改造，上述核酸分子在動物體內發育的早期階段表達與宿主動物同源 的IgM，該IgM作為BCR，有利于與動物自身的Iga和I相互作用，促進抗體的類型轉換為 IgG、親和力成熟和B細胞發育。
[0016] -種表達載體，包含上述核酸分子。一種細胞，包含上述核酸分子或上述載體。一 種動物，如豬、鼠，包含上述核酸分子。一種人源化抗體，由上述核酸分子重排、編碼制得。上 述核酸分子或載體或細胞在制備人源化抗體中的應用。上述核酸分子或載體或細胞在制備 轉基因動物中的應用。
[0017] 將經過上述改造的人免疫球蛋白基因轉入動物體內獲得轉人免疫球蛋白轉基因 動物，或進一步與自身免疫球蛋白基因不表達的動物進行雜交獲得只表達人抗體蛋白的基 因工程動物。利用抗原免疫轉入人免疫球蛋白基因（重鏈、輕鏈）的動物，獲得全人源化抗 體。例如：
[0018] 采用上述核酸分子或載體或細胞制備轉基因動物的方法，包括以下步驟：
[0019] (1)所述核酸分子的獲得；
[0020] (2)將所述核酸分子構建入載體；
[0021] (3)向宿主細胞(包括干細胞，誘導干細胞和體細胞)或胚胎導入含有所述核酸分 子的載體；
[0022] (4)將含有人Ig的細胞植入宿主動物的胚胎內（嵌合體制備)或體細胞克隆；
[0023] (5)繁育雜合、純合的轉人Ig基因的動物。（包括與宿主內源免疫球蛋白基因失活 的動物雜交）。
[0024] 上述宿主動物為哺乳動物，如鼠、兔、豬、牛、羊、雞、馬等。上述載體為人工染色體 (如酵母，細菌）、噬菌體、質粒等。上述載體導入宿主細胞的方法，包括電穿孔、病毒感染、月旨 質體轉染和顯微注射等。
[0025] 本發明所述宿主動物的IgM恒定區的基因片段、CH2部分序列是指編碼可結合宿主 動物信號蛋白Iga和/或Ig邱勺核苷酸序列。
[0026]有益效果
[0027] 1.本發明生產的全人源化抗體具有高親和力。
[0028] 2.本發明可利用一種轉基因動物品系產生不同類型的各種抗體，且本發明適用于 多種動物。
[0029] 3.本發明的宿主自身免疫球蛋白不表達或在檢測限度以下。