一種特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向序列及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程應用領域，具體涉及一種特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向 序列及應用。
【背景技術】
[0002] CRISPR_Cas9是細菌和古細菌在進化過程中演變出來的一種用于抵御外來侵害的 免疫入侵系統，包括抵御入侵的病毒以及外源DNA。在現代基因工程應用領域與TALEN (transcription activator-like effector nuclease)以及ZFN(zinc_finger nuclease) 技術并列成為三大基因組編輯工具。相比較于TALEN及ZFN技術，CRI SPR-Cas9技術具有特異 性DNA識別能力，在第二類CRISPR系統中，Cas9核酸內切酶在sgRNA引導下切割雙鏈DNA，造 成基因組雙鏈斷裂，利用細胞基因組修復的不穩定性產生非特異重組來產生修復錯誤(插 入或者缺失），從而可能產生移碼突變而造成基因功能的喪失，實現基因敲除的目的。其 sgRNA的設計和合成工作量遠遠小于TALEN和ZFN識別模塊的構建過程，且毒性遠遠低于ZFN 技術。但是CRISPR-Cas9技術也有上下文依賴性的缺點，目前只能應用于上游有PAM序列的 靶位點。
[0003] 多藥耐藥性(MDR)是指對一種藥物具有耐藥性的同時，對其他結構不同，作用靶點 不同的抗腫瘤藥物也具有耐藥性。多藥耐藥性是導致癌癥藥物治療和腫瘤化療失敗的重要 原因之一。而多藥耐藥性的主要機制之一就是ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白的過 量表達，它們可由ATP水解供能來將抗癌藥物栗出細胞外。它主要的家族成員包括六8081(卩-GP)、ABCC1(MRP1)和ABCG2(BCRP)等。細胞中ABCB1的高表達將會導致多藥耐藥的發生從而 使治療失敗，因此抑制或消除p-gp的表達能夠有效的解決在腫瘤治療中出現的多藥耐藥問 題。
【發明內容】
[0004] 為了克服現有技術中某些高表達p-gp蛋白的細胞中出現多藥耐藥性等缺點與不 足，本發明的首要目的在于提供一種特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向序列，該sgRNA導向 序列可以用于敲除人ABCB1基因，進而抑制或消除p-gp的表達。
[0005] 本發明的另一目的在于提供一種利用CRISPR-Cas9系統敲除人ABCB1基因的方法， 該方法采用CRISPR-Cas9技術對ABCB1基因進行編輯，使其正常序列發生缺失或者突變從而 達到敲除該基因的目的。
[0006] 本發明的再一目的在于提供上述特異靶向人ABCB1基因的SgRNA導向序列的應用。 [0007] 一種特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向序列，為Sgl或Sg2;其核苷酸序列分別為：
[0008] Sgl :5'-TTGGACTGTCAGCTGCTGTC-3'，位于基因 ABCB1 第八個外顯子；
[0009] Sg2:5'-GACTGTCAGCTGCTGTCGTC-3'，位于基因 ABCB1 的第五個外顯子；
[0010] 一種利用CRISPR-Cas9系統敲除人ABCB1基因的方法，包含如下步驟：
[0011] (1)在上述導向序列的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同時根據導向序列獲得 其對應的DNA互補鏈，并且在其5 '端加上AAAC得到反向寡核苷酸;分別合成上述正向寡核苷 酸和反向寡核苷酸，將合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸變性，退火，形成雙鏈；
[0012] ⑵將步驟(1)制得的雙鏈與Cas9載體連接，得到重組敲除表達載體；
[0013] (3)將步驟(2)制得的重組敲除表達載體與包裝系統共轉染包裝細胞，然后收獲病 毒純化并濃縮，得到病毒顆粒；
[0014] (4)將步驟(3)制得的病毒顆粒感染細胞，篩選穩轉細胞，得到成功敲除ABCB1基因 的細胞；
[0015] 步驟(2)中所述的Cas9載體優選為lentiCRISPRv2載體；
[0016]步驟(3)中所述的包裝細胞優選為293T細胞；
[0017]步驟(3)中所述的包裝系統中的包裝載體優選為pMD2.G和psPAX2;
[0018] 步驟(4)中所述的細胞優選為腫瘤多藥耐藥性細胞；
[0019] 步驟(4)中所述的細胞進一步優選為HCT-8/V或KBV200;
[0020]所述的特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向序列在制備抗腫瘤多藥耐藥性藥物中 的應用；
[0021]所述的腫瘤優選為人口腔鱗癌或人結直腸癌；
[0022]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0023] (1)為了最大限度避免脫靶現象的發生，選擇使用兩條sgRNA，即位于ABCB1基因兩 個不同位置。利用lentiCRISPRv2載體將sgRNA以及CRISPR系統引入目標細胞中，Cas9蛋白 會在sgRNA的引導下找到與其匹配的DNA序列，進行剪切。
[0024] (2)載體中含有Puromycin抗性基因，利用Puromycin對細胞進行篩選，未轉入 lentiCRISPRv2載體的細胞將在篩選過程中被淘汰。
[0025] (3)本發明提供的特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向序列，可通過CRISPR-Cas9系 統敲除或編輯ABCB1基因，進而抑制或消除p-gp的表達能夠有效的解決在腫瘤治療中出現 的多藥耐藥問題。
【附圖說明】
[0026]圖1是特異靶向人ABCB1基因的sgRNA導向序列的序列及其位置示意圖。
[0027]圖2是應用本發明設計的sgRNA對高表達p-gp的細胞株進行編輯后抽提細胞基因 組后進行測序與野生型細胞進行對比的測序分析圖。
[0028]圖3是實施例2PCR產物測序結果的測序峰圖。
[0029]圖4是成功敲除ABCB1基因的細胞株的p-gp蛋白表達量的western blot結果分析 圖。
[0030] 圖5是Doxorubicin、Vincristine和Ci splat in處理后，成功敲除ABCB1基因的細胞 株的細胞活性結果分析圖。
[0031]圖6是應用本發明設計的sgRNA對高表達p-gp的細胞株進行編輯后的藥物積累實 驗結果結果分析圖。
[0032]圖7是實施例3藥物積累實驗的流式結果分析圖。
[0033]圖8是實施例3藥物積累實驗流式結果的量化處理分析圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0035] 實施例中所使用的細胞株均購自六了0：，161^丨0?13?1^2載體購自六(1(^6116，內切酶 BsmBI 購自 Biolabs，Polyetherimide(PEI)購自 Ploysciences，Puromycin 和 Polybreen 購自 Sigma；
[0036] 實施例1
[0037] (l)sgRNA 設計
[0038] 根據人ABCB1基因的基因組序列（gene ID:5343)，設計2個靶向人ABCB1基因的 sgRNAdOnt的寡核苷酸sgRNA導向序列為：Sgl: 5 ' -TTGGACTGTCAGCTGCTGTC-3 '（位于基因 ABCB1第八個外顯子)和Sg2: 5 ' -GACTGTCAGCTGCTGTCGTC-3 '（位于基因 ABCB1的第五個外顯 子）（圖1);在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸(Forward oligo);根據導向序列獲得其 對應的DNA互補鏈，并且在其5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分別合成 上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward 〇1 igo和 Reverse oligo成對變性，退火;退火后可以形成連入表達載體lentiCRISPRv2載體的雙鏈， 同時將設計好的gRNA靶點序列進行blast比對以排除非特異性的靶切位點，具體寡核苷酸 序列見表1。
[0039]表1 sgRNA導向序列的寡核苷酸序列
[0040]
[0041 ] (2)構建表達sgRNA的載體
[0042] 病毒載體lentiCRISPRv2載體有BsmB I酶切位點，用BsmB I酶切，其中，酶切體系 (2〇yL 體系）為：BsmB I ΙμΜΙΟΧΝΕ buffer 2yL;質粒 lyL;ddH20 ΙθμΜ 酶切條件為：37°C 酶切lh;
[0043] 將酶切后的載體1 ent i CRI SPRv2分別與步驟（1)制得的退火雙鏈利用T4連接酶進 行連接，連接體系（10yL)為：退火雙鏈（Sgl或 T4DNA Ligase Buffer lyL，T4DNA Ligase lyL，ddH20 4yL;連接條件為：16°C連接過夜；
[0044] 將連接產物轉化感受態細胞stbl3,具體轉化方法為：-80°C取出感受態細胞 stbl3，與冰上溶解;然后50yL感受態細胞中加入lyL的上述連接產物，混勻后冰浴30min; 42 °C水浴90s，過程中勿搖動;冰上冷卻1~2min;然后加入800yL LB培養基，37°C搖床30min; 涂AMP+板（100yg/mL)培養過夜，挑取陽性克隆后37°C搖床過夜進行擴大培養，并用Hipure Plasmid Micro Kit C(Magen)抽提質粒并測序驗證，得到表達sgRNA的載體 lentiCRISPRv2-hABCBl-Sgl (導向序列為 Sgl)和 lentiCRISPRv2-hABCBl-Sg2(導向序列為 Sg2) (hABCBl表示為人基因 ABCB1)。
[0045] 實施例2
[0046] (1)核心質粒與包裝質粒pMD2. G和psPAX2共轉染至293T細胞中
[0047] 培養293T細胞，待293T細胞的匯集率達到50%~60%，種板后12~18h為最佳轉染 時間；轉染前更換新鮮培養液，60mm小皿中加入3mL培養基;轉染時質粒的使用量為核心質 粒（實施例 1 制得的lentiCRISPRv2-hABCBl-Sgl或lentiCRISPRv2-hABCBl-Sg 2,另取 lentiCRISPRv2空載體作為對照）4yg、psPAX2 3yg、pMD2.G lyg、PEI 24yL，補充DMEM至總體 積為200yL，加入順序分別為DMEM、PEI和質粒DNA(核心質粒、pMD2.G和psPAX2);然后室溫靜 止30min，使PEI與質粒DNA充分聚合，聚合結束后將轉染體系逐滴加入上述培養有293T細胞 的小皿中，輕輕搖勻后放入37°C5%C0 2培養箱中繼續培養；
[0048] (2)病毒的收獲與濃縮
[0049] 收集轉染后2處、4811、7211、9611 2931'細胞的上清液，每次收取病毒后再補充31^新 鮮培養液于小皿中，先收獲的病毒原液用封口膜封閉后可暫存4°C冰箱中；待病毒液全部收 集完成后l〇〇〇rpm離心5min，以去除細胞碎片，用0.45μπι濾膜過濾去除細胞碎片及其他雜 質；取過濾后的病毒原液于100kD超濾柱內，4°C，4000g離心30min，收集濾膜內剩余約300yL 病毒濃縮液，50yL每管分裝于1.5mL EP管內，置-80°C可長期保存，避免反復凍融；
[0050] (3)包裝病毒顆粒分別感染目的細胞株