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[0283] 表A.CYP102A1血紅素域(氨基酸殘基1-470)與各種結構表征的細胞色素 P450酶之 間的序列相似性
[0284]
[0285] *CYP505(P450foxy)未進行結構表征并且比對僅使用了血紅素域
[0286] 表B.CYP102A1整個序列與各種細胞色素 P450酶之間的序列相似性（相對于 Swissprot蛋白數據庫中的蛋白進行比對）。可以注意到，盡管屬于相同的子族，CYP102A2和 CYP102A3 僅 59 % 和 58 % 同源于 CYP102A1。
[0287]
[0288] 表C.氨基酸的物理特性
[0289]
[0290] 表D.親水性尺度(Hydropathy scale)
[0291]
[0292] 表1:CYP102A1變異體對萘的體外氧化活性、結合效率和選擇性。速率以nmol · mirT1 · (nmol P450廣1給出。僅可檢測的產物為1-萘酚(1-醇）。
[0293]
[0294] 表2:CYP102A1變異體對丙苯的體外氧化活性、選擇性和自旋迀移（spin shift)。 速率以nmol ·π?η-1 · (nmol P450)-1給出。產物為1-苯基-1-丙醇（1-醇）、1-苯基-2-丙醇 (2-醇）、2_丙基苯酚(鄰位)和4-丙基苯酚(對位）。也形成了少量的1-苯基-1-丙酮（< 1%) 和3-苯基-1-丙醇(〈0.5%，僅僅KT5)。一未檢測到。（*)由于這些和其他少數產物，百分數總 和不為100。
[0295]
[0297] 表3:CYP102A1變異體對甲苯的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物是芐醇（1-醇）、鄰甲酚(鄰位)和對甲酚(對位）。一未檢測到。
[0298]
[0300] 表4:CYP102A1變異體對丁苯的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物是1-苯基-1-丁醇（1-醇）、1-苯基-2-丁醇(2-醇）、4_苯基-2-丁醇 (3-醇）、2-丁基苯酚(鄰位)和4-丁基苯酚(對位）。（*)包括1 %~3 %的1-苯基-1 -丁酮。一未 檢測到。
[0301]
[0302]表5a :CYP102A1變異體對叔丁苯的體外氧化活性、選擇性和自旋迀移性。速率以 nmol ?mirT1· (nmol Ρ450Γ1給出。產物是2-叔丁基苯酸(鄰位）、4_叔丁基苯酸(對位)和2-甲基-2-苯基-丙-1-醇（1-醇）。一未檢測到。
[0303]
[0305] 表5b: CYP102A1變異體對乙苯的體外氧化活性/選擇性和自旋迀移性。速率以 nmol ·π?η-1 · (nmol P450)-1給出。產物是1-苯基乙醇（1-醇）、2_苯基乙醇（2-醇）、2_乙基 苯酚(鄰位)和苯乙烯。一未檢測到。
[0306]
[0307] 在檢測器響應重新校準后對于F87A、F87A/KT2、KSK19和GVQ也獲得了 NB/結果。 NADPH 轉化是相同的。結合效率為 23(F87A)、21(F87A/KT2)、25(KSK19)、26(GVQ)。產物生成 KT2)、95% (KSK19)、99% (GVQ)。苯乙烯現在對于這些變異體在反應中檢測到為2% (F87A)、 4% (F87A/KT2)、5% (KSK19)、1 % (GVQ)。
[0308] 表6a:CYP102變異體對鄰二甲苯（o-xylene)的體外氧化活性和選擇性。速率以 nmol · min-1 · (nmol P450)-1給出。產物是2-甲基節醇（1-醇）、2,3_二甲基苯酸（2,3-苯 酚）、3,4_二甲基苯酚(3,4_苯酚）、2,3_二甲基-對苯醌(氫醌)和焦兒茶酚(兒茶酚）。（*)由 于少數產物，百分數總和不等于100。一未檢測到。
[0309]
[0310] 表6b:CYP102Al變異體對間二甲苯的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · min <· (nmol Ρ450Γ1給出。產物是3-甲基芐醇（1-醇）、2,4_二甲基苯酚(2,4_苯酚)和2,6_二 甲基苯酚(2,6_苯酚）。（*)由于少數產物，百分數總和不等于100。
[0311]
[0313] 表7 :CYP102A1變異體對對甲基異丙基苯的體外氧化活性/選擇性和自旋迀移性。 速率以nm〇l .min-1 · (nm〇l P450)-1給出。產物是對-α-二甲基苯乙烯(對-α-DMS)、對-α-α-三甲基芐醇（i-Pr-醇）、4_異丙基芐醇(Me-醇）、麝香草酚、香芹酚和未鑒定的產物。（*)包含 高達3%的對-a-二甲基苯乙烯氧化物。（**)由于其他少數產物，百分數總和不等于100。一 未檢測到。
[0314]
[0315] 表8:-些CYP102A1變異體對枯烯的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · min-1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物是a-甲基苯乙稀(苯乙稀）、a-甲基苯乙稀氧化物(苯乙稀氧化物）、 2-苯基-1-丙醇（1-醇）、2_苯基-2-丙醇（2-醇）、2_異丙基苯酚(鄰位)和4-異丙基苯酚(對 位）。一未檢測到。
[0316]
[0318] 表8a:在進一步GC分析之后，一些CYP102A1變異體對枯烯的體外氧化活性和選擇 性。速率以nmol · min-1 · (nmol P450)-1給出。產物是α-甲基苯乙稀（苯乙稀）、α-甲基苯乙 烯氧化物(苯乙烯氧化物）、2_苯基-1-丙醇（1-醇）、2_苯基-2-丙醇（2-醇）、2_異丙基苯酚 (鄰位)和4-異丙基苯酚(對位）。一未檢測到。
[0319]
[0320]表9: CYP102A1變異體對戊烷的體外氧化活性、選擇性和自旋迀移性。速率以 nmol ?mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物是2-戊醇（2-醇）、3_戊醇（3-醇）、2_戊酮（2-酮)和 3_戊酮(3-酮）。
[0321]
[0323] 表10 :CYP102A1變異體對3-甲基戊烷的體外氧化活性/選擇性和自旋迀移性。速率 以nmol · min-1 · (nmol P450)-1給出。產物是3-甲基-2-戊醇（2-醇)-兩個非對映異構體標 記為(A)和(B)，和3-甲基-3-戊醇(3-醇）。
[0324]
[0325] 表11 :CYP102A1變異體對2-甲基丁烷的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物是2-甲基-1-丁醇（1-醇）、2_甲基-2-丁醇(2-醇）、3_甲基-2_丁醇(3-醇）、3-甲基-1-丁醇(4-醇)和3-甲基-2-丁酮(3-酮）。一未檢測到。
[0326]
[0328] 表12:-些CYP102A1變異體對丁烷和丙烷的體外氧化活性和選擇性。速率以 nmol ?mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物對于丁烷是1-丁醇（1-醇）、2_丁醇(2-醇)和2-丁酮 (2-酮），而對于丙烷僅為2-丙醇。
[0329]
[0330] 表13:CYP102A1變異體對辛烷的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · min-1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物為2-辛醇(2-醇）、3_辛醇(3-醇）、4_辛醇(4-醇）、3_辛酮(3-酮)和 4_辛酮(4-酮）。一未檢測到。
[0331]
[0333] 表14: 一些CYP102A1變異體對1，4_二氯苯的體外氧化活性和選擇性。速率以 nmol .mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物為2,4-二氯苯酚和/或2,5-二氯苯酚，其具有相同 的GC洗脫次數。進一步氧化成GC-不可檢測的半醌會使偶合數字不可靠。
[0334]
[0335] 表15: CYP102A1變異體對朱欒倍半萜的體外氧化活性和選擇性。速率以nmol · mirT1 · (nmol Ρ450Γ1給出。產物為順式-和反式-香柏醇(香柏醇）、香柏酮、順式-和反式-朱欒倍半砲環氧化物(Val. epox.)以及順式-和反式-香柏酮環氧化物(Noot. epox.)。
[0336] LU&B」 衣一些(JYPiUZAi父并懷對K-和S-i，8-帖二輝的懷外氧化沽?生和選徉?生。迷準 以nmol .min-1 · (nmol P450)-1給出。產物為1,2-1,8-砲二稀環氧化物(環氧化物），順式- 和反式-異胡椒醇(異胡椒(isopiper))，以及順式和反式香芹醇(香芹醇）。
[0339]
[0340] 表16a:CYP102Al變異體對R-l，8-萜二烯的體外氧化活性和選擇性。N=NADPH轉化 速率。C =偶合。PFR =產物生成速率。速率以nmol ·π?η-1 · (nmol P450)-l為單位。產物為 順，2_1，8-砲二稀環氧化物(順-1，2)、反-1，2_1，8_砲二稀環氧化物(反-1，2)、未鑒定廣 物（U)、順-異胡椒醇（順-3-醇）、反-異胡椒醇（反-3-醇）、香芹醇（2異構體）（6-醇(A)和 (B))、香芹酮(6-酮)和紫蘇子醇（10-醇）。
[0341]
[0343] 表17:-些CYP102A1變異體對（ + )-α-蒎烯的體外氧化活性和選擇性。速率以 nmol ·η?η-1 · (nmol P450)-l給出。產物為2,3-薇稀環氧化物(環氧化物），順式-和反式-馬鞭草烯醇（馬鞭草烯醇）、馬鞭草烯酮和桃金娘烯醇。由于在底物中的雜質，數據夸大偶 合。
[0344]
[0345] 表17a:-些CYP102A1變異體對（ + )-α-蒎烯的體外氧化活性和選擇性。速率以 nmol .min-l · (nmol P450)-l給出。N=NADPH轉化速率。C =偶合。PFR =產物生成速率。速 率以nmol · min-1 · (nmol P450)-l給出。產物為(-)-2,3-薇稀環氧化物（（-)-2,3)、（ + )-2， 3_蒎烯環氧化物（（+) _2，3)、順-馬鞭草烯醇(順-4-醇）、反-馬鞭草烯醇(反-4-醇）、馬鞭草 烯酮(4-酮)和桃金娘烯醇（10-醇）。
[0346]
[0347] 表18:CYP102A1變異體對芴的體外氧化活性和選擇性。N = NADPH轉化速率。C =偶 合。PFR =產物生成速率。所有速率以nmol ·π?η-1 · (nmol P450)-l給出。產物為9-芴醇(9-醇)和2-芴酮(9-酮）。
[0348]
[0349] 表19:CYP102A1變異體對β-紫羅酮的體外氧化活性和選擇性。N=NADPH轉化速率。 C =偶合。PFR =產物生成速率。速率以nmol ·π?η-1 · (nmol P450)-l給出。產物為4-羥基-β-紫羅酮(4-醇）。
[0350]
[0351] 表20:CYP102A1變異體對月桂(十二）酸的體外氧化活性和選擇性。N = NADPH轉化 速率。C =偶合。PFR =產物生成速率。速率以nmol ·π?η-1 · (nmol P450)-l給出。產物為11-羥基十二酸（ω-1)、1〇-羥基十二酸（ω-2)、9_羥基十二酸（ω-3)、8_羥基十二酸（ω-4)和 7-羥基十二酸（ω -5)。
[0352]
[0353] 本發明的序列(CYP102A1野生型)
[0354]
[0355]
[0356]
[0357]
[0358]
【主權項】
1. 一種突變CYP102A1酶，其具有增強的單加氧酶活性和/或改變的產物選擇性并且在 一個或多個氨基酸殘基位置330、191、401、403、307、377、425、276、117、131或215處包括取 代。2.根據權利要求1所述的酶，其與CYP102A1的氨基酸殘基1-480享有至少40%同源性， 并且可選地是其突變片段。3.根據權利要求1或2所述的酶，其包括代表CYP102A1未突變片段的1、2、3、4、5或更多 段的至少15個或至少20個鄰近氨基酸。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的酶，其具有： i) 在位置117、131、215、330、401中的一個或多個處的保守突變;和/或 ii)在位置191和276中的一個或多個處的極性氨基酸;和/或 iii)在位置377和403中的一個或多個處的非極性氨基酸;和/或 iv)在位置425處的不帶電殘基， 其中，可選地在側接位置117、131、191、215、276、307、330、377、401、403或425中的一個 或多個的位置處沒有突變。5.根據權利要求1至4中任一項所述的酶，其另外包括在以下位置中的一個或多個處的 取代：47、51、74、82、87、171、188、239、259、263、264、267、319、328或353。6.根據權利要求5所述的酶，其包括選自：R47L、Y51F、A74G、A82L、F87A、F87G、F87L、 !117比、1^1880、吧3冊、1259￥、1263厶^2646』267￥川319￥^328￥或1^3531的突變。7.根據權利要求1至6中任一項所述的突變CYP102A1酶，其中，所述突變體包括一個或 多個以下突變或突變組： i)A330P； ii)A191T/N239H/I259V/A276T/L353I； iii)F87A/H171L/Q307H/N319Y； iv)F87A/A330P/E377A/D425N； v)F87A/A117V/E131D/L215I； vi)I401P； vii)R47L/Y51F/I401P； viii)F87A/I401P； ix)R47L/Y51F/F87A/I401P； x)R47L/Y51F/A330P/I401P； xi)Q403P； xii)R47L/Y51F/Q403P； xiii)R47L/Y51F/F87A/Q403P。8. 用于氧化作為有機化合物的底物的方法，所述方法包括用如權利要求1至7中任一項 所限定的酶來氧化所述有機化合物底物。9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述底物是短鏈烷烴、或其取代衍生物，或為芳香 化合物、或烷基苯、或其取代衍生物。10. 根據權利要求8所述的方法，其中，所述底物是鹵代芳香化合物或無環或環狀的萜 或類砲或倍半砲，或環稀經或飽和脂肪酸;或其任何的取代衍生物。11. 根據權利要求9或10所述的方法，其中，所述短鏈烷烴是戊烷、3-甲基戊烷、2-甲基 丁燒、丁燒、丙烷、乙燒和甲燒;或其中，所述烷基苯是丙基苯、乙基苯、甲苯、丁基苯、叔丁基 苯、鄰二甲苯、間二甲苯、枯烯、對甲基異丙基苯和乙基茴香醚;或其中，所述芳香化合物是 萘或芴；或其中，所述單萜是1，8_萜二烯或蒎烯；或其中，所述倍半萜是朱欒倍半萜；或其 中，所述類萜是紫羅酮如β-紫羅酮或突厥酮;或其中，所述飽和脂肪酸是月桂酸或癸酸。12. -種抗體，其選擇性地結合權利要求1至7中任一項所述的酶且其不結合至 CYP102A1。13. -種多核苷酸，其包含編碼如權利要求1至7中任一項所限定的酶的序列，可選地以 載體形式。14. 一種細胞，其表達權利要求1至7中任一項所限定的酶。15. 根據權利要求14所述的細胞，其為原核細胞或真核細胞。16. 根據權利要求15所述的細胞，其為大腸桿菌（Escherichiacoli)、假單胞菌屬 (Pseudomonassp·)、酵母、畢赤酵母屬(Pichiasp·)、紅球菌屬(Rhodococcussp·)、芽抱 桿菌屬(Bacillussp.)的菌株。17. -種轉基因動物或植物，其細胞如權利要求14至16中任一項所限定的。18. 根據權利要求8至11中任一項所述的方法，其中，所述有機化合物底物在根據權利 要求14至16中任一項所述的細胞中氧化。19. 如權利要求8至11中任一項所限定的處理被底物污染的位點的方法，包括用根據權 利要求1至7中任一項所述的酶或一種或多種酶的混合物、或權利要求14至16中任一項限定 的細胞、或權利要求17中限定的轉基因動物或植物接觸所述位點。20. 根據權利要求8至11或18中任一項所述的方法，其中，相比于如果用CYP102A1實施 所述方法，形成不同數量的產物。
【專利摘要】本發明涉及突變酶，特別涉及具有增強性能的突變酶和使用這種酶氧化有機化合物底物的方法。本發明提供一種突變CYP102A1酶，其具有增強的單加氧酶活性和/或改變的產物選擇性并且在一個或多個氨基酸殘基位置330、191、401、403、307、377、425、276、117、131或215處包括取代。
【IPC分類】C12N15/53, A01K67/00, C12P7/02, A01H5/00, C07K16/40, C12N9/02
【公開號】CN105441397
【申請號】CN201510867081
【發明人】呂特·洛克·翁, 史蒂芬·格雷厄姆·貝爾, 克里斯托弗·懷特豪斯
【申請人】Isis創新有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2008年10月8日
【公告號】CN101889080A, CN101889080B, EP2207877A2, EP2207877B1, EP2548952A2, EP2548952A3, US9133443, US20100240106, US20150376580, WO2009047498A2, WO2009047498A3