循環式單細胞捕獲芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微流控技術領域，特別是涉及一種循環式單細胞捕獲芯片。
【背景技術】
[0002]隨著生物技術研究手段的不斷發展，生物學的研究層面正從細胞種群向單細胞層面深化拓展。每個細胞在時空上都是獨一無二的，盡管它們可能來自同一祖先，但是不同的時空環境決定了它們各自特異的遺傳表達，從而產生了不同的生物性狀，這對于進化、耐藥性、基因表達等研究具有重要價值。然而基于細胞種群的分析方法往往會掩蓋群體內不同細胞間出現的差異，忽略這些少量但重要的信息。因此迫切需要研發基于單細胞的培養及分析方法，用來研究不同細胞個體間的差異性，了解細胞的遺傳與代謝機制。
[0003]從大量細胞中獲得單個細胞是進行單細胞培養與分析的第一步。傳統的單細胞獲取方法常采用對細胞群進行大量稀釋或者顯微操作的方法來進行。整個操作步驟復雜繁瑣，單細胞獲得效率低。微流控技術是上世紀九十年代在分析化學領域發展起來的，它以微管道網絡微結構特征，通過微加工技術將微管道、微泵、微閥、微儲液器、微檢測元件等功能元器件像集成電路一樣，集成在芯片材料上。微流控技術在分離捕獲單細胞方面很高的效率，通過在芯片上制作微孔、微篩、微電極等結構，能夠在較短時間捕獲大量單細胞，在單細胞捕獲培養研究方面已經有多個成功的應用范例。
[0004]美國專利申請US20120009671A1中描述了一種基于微孔的單細胞捕獲方案，該芯片上有上千個160 μ?? (長)X 160 μ?? (寬)X 160 μπι (深)的微孔，各微孔頂部均有液體管道相連，捕獲前，先將細胞濃度稀釋到合適水平，然后將稀釋的細胞液注入液體管道，使各微孔充滿液體后停止注入細胞液，此時液體管道中的細胞在重力作用下沉入微孔，通過調整細胞液的稀釋度可以確保約有10%~30%的微孔中含有單個細胞。捕獲的單細胞在微孔中進行培養，培養液更換則通過以每秒2 _的速度注入培養液來實現。此芯片能夠實現160~480個單元的單細胞培養。
[0005]針對上述單細胞捕獲方案，由于單個細胞捕獲是基于單細胞在平面上的均勻分布實現的，這就需要調整輸入細胞的濃度，使單個微孔的水平區域僅含有一個細胞，盡管如此，多數微孔或是未捕獲到細胞，或是捕獲到兩個及以上的細胞，能夠捕獲到單個細胞的微孔數量比例仍然比較低(10~30%)。而且，微孔中細胞捕獲數量的不確定性使得必須要通過顯微成像對所有微孔區域的細胞數量進行判別，從中挑出少數具有單個細胞的微孔，整個判別過程耗時且工作量比較大。另外，由于僅靠重力將單細胞捕獲在微孔中，捕獲力較弱，細胞容易隨高流速的液流而流失，因此在培養液換液時，液流流速需要控制在每秒2mm以下，這增加實驗過程的復雜性，提高操作難度大。從總體看，由于細胞捕獲依賴于微孔中的流場分布，這對于微孔的形制有較大要求；由于微孔不僅作為捕獲結構，還需要作為培養結構，因此特定的微孔形制也決定了有限的細胞培養空間結構。
[0006]已公開的技術文獻(Lab Chip, 2012，12，765)公開了一種基于微篩的單細胞捕獲芯片，該芯片具有多個串聯圓形腔室，每個腔室中央有一對由兩個微柱組成的微篩結構。當細胞注入腔室時，單個細胞會被阻滯于微篩處，從而被捕獲，進而微篩外圍的上方的圓形微閥通過加壓，閥膜向下方的液體管道彎曲形變，將微篩區域與外界液體管道隔離，形成一獨立腔室，捕獲的單細胞即在其中培養生長。換液操作時，微閥開放數百毫秒后再次快速關閉，微閥隔離區域外的新液在此數百毫秒短時間內擴散進入微閥隔離區域內。該芯片在輸入細胞數量為10000~25000個條件下，約有75%的微篩能夠捕獲到單細胞。由于需要細胞與液流管道中的微篩接觸才能捕獲單個細胞，因此捕獲成功很大程度上取決于細胞與微篩接觸的機率。然而由于微篩的橫向直徑很小，大部分細胞與微篩接觸的機率很小，大都會繞過微篩，最后流出芯片。為了能夠實現一定的被捕獲單細胞數量，需要輸入較多量的細胞，在該文獻中，細胞數量約為10000~25000個，細胞輸入數量需求高，這對于一些數量少的細胞樣品而言，難以適用。同時，該芯片上捕獲到單細胞的微篩僅占70%，為了獲得盡可能多的單細胞，需要進一步提升微篩捕獲效率。本發明因此而來。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提出一種捕獲單個細胞的循環式單細胞捕獲芯片，該芯片通過液體循環流動，從中捕獲單個細胞的芯片方案，通過該芯片，能夠從注入的少量細胞中捕獲得到多個單細胞。
[0008]為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案如下:
一種循環式單細胞捕獲芯片，包括:
液流層，包含環狀液流管道，所述液流管道分別通過液流輸入管道、液流輸出管道與芯片外部連通，且所述液流輸入管道和液流輸出管道上還分別設有用以將所述液流管道與外界隔離的微閥；
微篩，至少用以截留流經所述液流管道的液流內的單個細胞；
微泵，至少用以驅使液流在所述液流管道內單向循環流動。
[0009]進一步的，所述微閥可設置在所述微篩的上游或者下游。
[0010]進一步的，所述微篩包括連接在液流管道管壁上的一個以上微柱組，所述微柱組包括一個以上微柱，且其中一個微柱與液流管道管壁之間形成有能夠阻滯單個細胞但使液流中的液體通過的間隙，或者其中兩個微柱之間形成有能夠阻滯單個細胞但使液流中的液體通過的間隙。
[0011]進一步的，所述芯片包括設于所述液流層上的彈性膜層，所述彈性膜層包括彈性膜。
[0012]進一步的，所述微篩包括連接在所述彈性膜暴露于所述液流管道內的局部表面上的一個以上微柱組，所述微柱組包括一個以上微柱，且其中一個微柱與液流管道管壁之間形成有能夠阻滯單個細胞但使液流中的液體通過的間隙，或者其中兩個微柱之間形成有能夠阻滯單個細胞但使液流中的液體通過的間隙。
[0013]進一步的，所述微柱的形狀可選自但不限于圓柱形、長方體、梯臺、圓錐體、開放式槽型結構(例如，新月形結構)的一種或者兩種以上的任意組合。
[0014]進一步的，所述芯片還包括設置在所述彈性膜層上的氣動控制層，所述微泵包括分布于所述氣動控制層內的兩條以上第三氣動控制管道，當在設定時段向其中兩條以上第三氣動控制管道內分別輸入具有不同壓力的流體時，該兩條以上第三氣動控制管道能夠分別驅使所述彈性膜的不同局部區域產生不同程度的形變和/或位移，從而在液流管道內產生能夠驅使液流單向流動的力。
[0015]進一步的，所述微閥包括能夠驅使彈性膜的局部區域擠壓液流輸入管道和/或液流輸出管道，從而在所述液流輸入管道和/或液流輸出管道內的選定位置阻斷液流的驅動機構。
[0016]進一步的，所述驅動機構至少可選自但不限于電致動機構、磁致動機構、光致動機構、液壓驅動機構或氣動機構O
[0017]進一步的，所述芯片還包括設置在所述彈性膜層上的氣動控制層，所述微閥包括分布于所述氣動控制層內的至少一第一氣動控制管道和至少一第二氣動控制管道，當在設定時段向所述第一氣動控制管道或第二氣動控制管道內輸入具有設定壓力的流體時，所述第一氣動控制管道或第二氣動控制管道能夠驅使所述彈性膜的局部區域擠壓液流輸入管道和/或液流輸出管道，從而在所述液流輸入管道或液流輸出管道內的選定位置阻斷液流。
[0018]其中，所述第一氣動控制管道和第二氣動控制管道還可一體設置，S卩，以一條與液流輸入管道、液流輸出管道均交叉的氣動控制管道實現微閥的功能。
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