一種重組抗雙酚a單克隆抗體及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種新的抗雙酚A單克隆抗體，及其制備方 法和用途。
【背景技術】
[0002] 雙酚A，也稱BPA，是重要的有機化工原料，苯酚和丙酮的重要衍生物，工業上又叫 作聚碳酸酯。雙酚A是世界上使用最廣泛的工業化合物之一，主要用于生產聚碳酸酯、環氧 樹脂、聚砜樹脂、聚苯醚樹脂、不飽和聚酯樹脂等多種高分子材料。也可用于生產增塑劑、阻 燃劑、抗氧劑、熱穩定劑、橡膠防老劑、農藥、涂料等精細化工產品。
[0003] 在塑料制品的制造過程中，添加雙酚A可以使其具有無色透明、耐用、輕巧和突出 的防沖擊性等特性，尤其能防止酸性蔬菜和水果從內部侵蝕金屬容器，因此廣泛用于罐頭 食品和飲料的包裝、奶瓶、水瓶、牙齒填充物所用的密封膠、眼鏡片以及其他數百種日用品 的制造過程中。雙酚A在生活中應用廣泛，成為人們經常能接觸到的物質。
[0004] 資料表明，雙酚A屬低毒性化學物。動物試驗發現雙酚A有模擬雌激素的效果，即 使很低的劑量也能使動物產生雌性早熟、精子數下降、前列腺增長等作用。此外，有資料顯 示雙酚A具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明顯增加動物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌癥 的發生。
[0005] 研究表明，當含有雙酚A的塑料奶瓶被加熱時，雙酚A極易從奶瓶中釋放出來，轉 移至與其接觸的食品中，對嬰幼的身體健康產生危害。
[0006] 目前較多國家對雙酚A不是限用，而是禁止使用了，同時目前我國GB 13116 - 1991食品容器及包裝材料用聚碳酸酯樹脂衛生標準規定了酚的溶出量應低于0. 05mg/L。 另外國家已經發布了雙酚A標準包括《GB/T23296. 16-2009食品接觸材料高分子材料食品 模擬物中2,2-二（4-羥基苯基）丙烷（雙酚々的測定高效液相色譜法》、《5~八2282-2009 食品接觸材料高分子材料食品模擬物中雙酚A的測定高效液相色譜法》、《SN/T2379-2009 聚碳酸酯樹脂及其成型品中雙酚A的測定氣相色譜-質譜法》、《SN/T2407-2009玩具中苯 酚和雙酚A的測定》，已立項尚未發布的國家標準包括《20090893-T-607食品塑料包材中 雙酚A殘留量的測定（超高壓液相色譜法）》。但這些常用HPLC的檢測方法的檢測低限為 0. lmg/L，達不到GB 13116 - 1991食品容器及包裝材料用聚碳酸酯樹脂衛生標準規定了酚 的溶出量應低于〇. 〇5mg/L。另外這些檢測方法存在檢測成本高，檢測樣本數量有限，對檢測 員前期技能培訓要求較高等弊端。
[0007] 與常規儀器檢測方法相比，ELISA法具有特異性強、操作簡便、儀器化程度和分析 成本低、檢測時間短、樣品容量大等優點，尤其適用于大規模樣本的快速檢測。因此建立的 高通量檢測方法能夠確保快速大批量檢測樣品，為保證食品接觸材料達到相應的安全標準 提供檢測基礎。
[0008] 現有技術中，還未有能夠高效檢測雙酚A的方法的報道。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種重組抗雙酚A單克隆抗體及 其制備方法和用途。
[0010] 本發明的第一方面提供了一種重組抗雙酚A單克隆抗體，所述抗體含有輕鏈可變 區和重鏈可變區，輕鏈可變區具有SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。
[0011] 本發明第二方面提供了一種多核苷酸，其編碼所述重組抗雙酚A單克隆抗體。
[0012] 本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。
[0013] 編碼所述單克隆抗體的多核苷酸序列可以通過本領域技術人員熟知的任何適當 的技術制備。所述技術見于本領域的一般描述，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等， 科學出版社，1995)。包括但不限于重組DNA技術、化學合成等方法。
[0014] 在本案的較佳實施例中，編碼上述單克隆抗體的多核苷酸為DNA分子，所述DNA分 子含有SEQ ID N0 :1所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區核苷酸序列，以及SEQ ID N0 : 2所示的編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列。
[0015] 本發明第三方面提供了一種表達載體，其含有所述多核苷酸以及與該序列操作性 相連的表達調控序列。
[0016] 本領域的技術人員熟知的方法能用于構建所述載體。這些方法包括重組DNA技 術、DNA合成技術等。可將編碼所述單克隆抗體的DNA有效連接到載體中的多克隆位點上， 以指導mRNA合成進而表達蛋白，或者用于同源重組。
[0017] 較佳的，所述載體為原核載體或穿梭質粒等。
[0018] 本發明第四方面提供了一種宿主細胞，其被所述載體所轉化。
[0019] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門菌、李斯 特細菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO, C0S. 293細胞、或 Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
[0020] 本發明第五方面提供了一種制備上述重組單克隆抗體的方法，該方法具體包括如 下步驟：
[0021] a)獲得目的基因片段；
[0022] b)將目的基因融合片段插入表達載體中；
[0023] c)將獲得的表達載體轉化真核宿主細胞；
[0024] d)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養步驟c)所得的真核宿主細胞；
[0025] e)分離純化獲得所述重組單克隆抗體。
[0026] 較佳的，步驟a)中，所述目的基因含有SEQ ID N0:1所示的編碼所述單克隆抗體 輕鏈可變區核苷酸序列，以及SEQ ID N0 :2所示的編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷 酸序列。
[0027] 較佳的，步驟b)中，所述表達載體可以是常規的原核系統表達載體，優選pNP表達 載體。
[0028] 較佳的，步驟c)中，可將獲得的表達載體轉化大腸桿菌，優選大腸桿菌DH5a ;宿主 細胞，可優選CHO細胞。
[0029] 較佳的，步驟e)中，分離純化方法為：用ProteinA親和層析柱從細胞培養上清中 直接分離純化出上述單克隆抗體。
[0030] 本發明第六方面，提供了所述的重組單克隆抗體在定性或定量檢測雙酚A中的用 途。
[0031] 本發明的第七方面提供了一種采用所述抗雙酚A單克隆抗體在檢測雙酚A的方 法。較佳的，所述的方法為ELISA法。
[0032] 本發明的有益效果為：
[0033] 本發明的重組單克隆抗體能快速、靈敏地檢測食品包裝材料中雙酚A的含量。檢 測低限將達到〇. 〇〇lug/ml，具有極高的選擇性和靈敏性，使有毒有害物分析的過程步驟大 大簡化。
【附圖說明】
[0034] 圖1 :本發明所構建的pNP(H+L)載體。含有重組抗雙酚A抗體輕鏈全長基因和重 鏈全長基因。其中，hCMV pro為人巨細胞病毒早期啟動子；Ck為銷售κ輕鏈恒定區基因； IgG constant為銷售γ1重鏈恒定區基因；pA為多聚腺苷化信號；DHFR為二氫葉酸還原酶 基因；AmpR為氨芐青霉素抗性基因。
[0035] 圖2 :抗雙酚A單克隆抗體SDS電泳圖。Μ泳道為蛋白分子量Marker，DTT+泳道為 抗體還原狀態，DTT-泳道為抗體非還原狀態。
【具體實施方式】
[0036] 本發明涉及一種重組的抗雙酚A單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變 區，輕鏈可變區具有SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID N0 :2所示的 氨基酸序列。
[0037] 本文所用的術語"單克隆抗體（單抗）"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即 該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高 特異性地針對單個抗原點。而且，與常規多克隆抗體制劑（通常具有針對不同決定簇的不 同抗體）不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗 體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語"單 克隆"表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特 殊方法來產生抗體。
[0038] 本文所用的術語"抗體"和"免疫球蛋白"是有相同結構特征的約150000道爾頓 的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈（L)和兩個相同的重鏈（H)組成。每條輕鏈通過一 個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重 鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區（VH)，其后是多個恒定區。 每條輕鏈的一端由可變區（VL)，另一端有恒定區：輕鏈的恒定區與重鏈的第一個恒定區相 對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的氨基酸在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界 面。
[0039] 本文所用的術語"可變"表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成 各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可 變區中。它集中于輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區（CDR)或超變區中的三個片段中。 可變區中較保守的部分稱為架構區（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區， 它們大致上呈P -折疊構型，由形成接連環的三個⑶R相連，在某些情況下可形成部分P折 疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR -起形成了抗體的 抗原結合部位（參見Kabat等，NIH PuB，No. 91-3242,卷I，647-669頁（1991))，恒定區不 直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴于抗 體的細胞毒性。
[0040] 單克隆抗體可用本領域技術人員熟知的各種方法