革蘭氏陽性細菌特異性結合化合物的制作方法
【專利說明】革蘭氏陽性細菌特異性結合化合物
[00011 本申請是申請日為2010年07月15日、中國申請號為201080041138.6、發明名稱為 "革蘭氏陽性細菌特異性結合化合物"的發明申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及生物學、免疫學和醫學領域。
[0003] 革蘭氏陽性微生物引起多數系統感染。這些革蘭氏陽性病原體的一個重要成員是 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)。約20%的群體是金黃色葡萄球菌的 長期攜帶者。金黃色葡萄球菌能引起一系列病，從局部的皮膚感染，諸如丘疹、膿皰病(也可 由釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)引起）、_、蜂窩織炎、毛囊炎、疔瘡、癰、皮膚燙傷 綜合征和膿腫，到危及生命的疾病，諸如肺炎、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎、中毒性休克綜合 征(TSS)、和敗血癥。金黃色葡萄球菌能夠感染所有種類的器官和組織。金黃色葡萄球菌感 染發生于免疫勝任的以及免疫受損的人。美國重癥監護室中約50%的感染是由這種病原體 引起的。美國每年報告300,000例金黃色葡萄球菌感染，導致12,000例死亡（Moran et al.NEMJ 355,666-674(2006))。
[0004] -個主要問題是金黃色葡萄球菌越來越強的抗生素抗性。甲氧西林抗性金黃色葡 萄球菌(MRSA)出現于二十世紀六十年代。它最初是在醫療環境中鑒定到的。然而，MRSA表現 為存在于從未住院的社會中的人。MRSA的治療是困難且昂貴的，原因在于MRSA對抗生素的 有限敏感性。然而，可用的抗生素備選很少。常常使用萬古霉素來治療青霉素抗性MRSA。美 國專利6，939，543記載一種針對脂磷壁酸(LTA)的鼠抗體，其能夠結合金黃色葡萄球菌。基 于這種鼠抗體，生成了一種重組嵌合小鼠/人抗體，其含有人重鏈和輕鏈恒定域。然而，此類 嵌合小鼠/人抗體具有存在鼠序列的缺點，這涉及施用于人時嚴重副作用的發現。
[0005] 本發明的一個目標是提供用于抵抗和/或預防革蘭氏陽性細菌相關疾病的手段和 方法。本發明的又一個目標是提供備選的和/或改良的針對各種革蘭氏陽性細菌，優選葡萄 球菌屬物種，更優選的MRSA的結合化合物。本發明的又一個目標是提供針對各種革蘭氏陽 性細菌，優選葡萄球菌屬物種，更優選MRSA的人結合化合物。
[0006] 具體地，本發明涉及下述各項：
[0007] 1.-種抗體或其功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物，其包含：
[0008] -重鏈⑶R1序列，其包含與序列RFAMS具有至少70 %序列同一性的序列，和/或 [0009 ]-重鏈⑶R2序列，其包含與序列SI NNGNNPYYARSVQY具有至少70 %序列同一性的序 列，和/或
[0010]-重鏈CDR3序列，其包含與序列DHPSSGWPTFDS具有至少70%序列同一性的序列， 和/或
[0011]-輕鏈⑶R1序列，其包含與序列RASENVGDWLA具有至少70%序列同一性的序列，和/ 或
[0012]-輕鏈CDR2序列，其包含與序列KTSILES具有至少70%序列同一性的序列，和/或 [0013]-輕鏈CDR3序列，其包含與序列QHYXRFPYT具有至少70%序列同一性的序列，其中X 為I或M。
[0014] 2.依照項1的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其具有重鏈序 列和/或具有輕鏈序列，該重鏈序列包含與序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWV RQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGT LVTVSS具有至少70%序列同一性的序列，該輕鏈序列與序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRAS ENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTK LEIKRTV具有至少70%序列同一性，其中X為I或Μ。
[0015] 3.依照項1的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其具有重鏈序 列和/或具有輕鏈序列，該重鏈序列包含與序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWV RQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGT LVTVSS具有至少70%序列同一性的序列，該輕鏈序列與序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRAS ENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTK LEIKRA具有至少70%序列同一性，其中X為I或Μ。
[0016] 4.依照項1的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，具有重鏈序列 和/或具有輕鏈序列，該重鏈序列包含與EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGR GLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 序列具有至少70 %序列同一性的序列，該輕鏈序列與序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASEN VGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKVE IKRTV具有至少70%序列同一性，其中X為I或Μ。
[0017] 5.依照項1的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其具有重鏈序 列和/或具有輕鏈序列，該重鏈序列包含與序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWV RQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGT LVTVSS具有至少70%序列同一性的序列，該輕鏈序列與序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRAS ENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTK LEIKRTV具有至少70%序列同一性，其中X為I或Μ。
[0018] 6.依照項1的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其具有重鏈序 列和/或具有輕鏈序列，該重鏈序列包含與序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWV RQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGT LVTVSS具有至少70%序列同一性的序列，該輕鏈序列與序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRAS ENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTK LEIKRA具有至少70%序列同一性，其中X為I或Μ。
[0019] 7.依照項1的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其具有重鏈序 列和/或具有輕鏈序列，該重鏈序列包含與序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWV RQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTVSRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGT LVTVSS具有至少70%序列同一性的序列，該輕鏈序列與序列DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRAS ENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTK VEIKRTV具有至少70%序列同一性，其中X為I或Μ。
[0020] 8.依照項1-7任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其中 一個或多個天冬酰胺已被另一種氨基酸替換。
[0021] 9.依照項8的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其中所述天冬 酰胺是重鏈第53位處的天冬酰胺，其中氨基酸編號方式依照Kabat(1991)。
[0022] 10.依照項8或9的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其中所述 其它氨基酸是絲氨酸。
[0023] 11.依照項1-10任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其 中至少一個半胱氨酸以外的氨基酸已用半胱氨酸替換。
[0024] 12.依照項11的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其中所述至 少一個半胱氨酸以外的氨基酸是輕鏈第205位處的纈氨酸和/或輕鏈第110位處的纈氨酸， 和/或重鏈第114位處的丙氨酸，其中氨基酸編號方式依照Kabat( 1991)。
[0025] 13.依照項1-12任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其 為人抗體。
[0026] 14· -種分離的抗體，其結合體內生長的金黃色葡萄球菌(S·aureus) 〇
[0027 ] 15.項14的抗體，其中所述抗體是人的。
[0028] 16.-種抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其能夠結合SD重復 依賴性表位。
[0029] 17.-種抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其能夠結合金黃色 葡萄球菌 CIfA、CIfB、SdrC、ScM^PSdrE。
[0030] 18.-種抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物，其能夠與依照項1-13任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物競爭對葡萄球菌屬物種的 結合。
[0031] 19. -種長度為至少15個核苷酸的分離的、合成的或重組的核酸序列或其功能性 等同物，其編碼依照項1-13任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物的 至少一種⑶R序列。
[0032] 20.-種分離的合成的或重組的核酸序列或其功能性等同物，其包含與選自下組 的序列具有至少 70 % 序列同一性的序列：cgctttgccatgagc，tcgatcaataatgggaataacccata ctacgcacggtcggtacaatac，gatcaccctagtagtggctggcccacctttgactcc，cgggccagtgaaaacgt tggtgactggttggcc，aagacatctattctagaaagt^Pcaacactatatacgtttcccgtacact 〇
[0033] 21.依照項20的核酸序列或功能性等同物，其中所述核酸序列或功能性等同物包 含與圖1所示核苷酸序列的至少部分具有至少70%序列同一性的序列，所述部分具有至少 15個核苷酸且編碼至少一種⑶R區。
[0034] 22.依照分離的、合成的或重組的核酸序列或其功能性等同物，其包含編碼下述氨 基酸序列的序列，所示氨基酸序列與序列RFAMS具有至少70%序列同一性，和/或與序列 SINNGNNPYYARSVQY具有至少70 %序列同一性，和/或與序列DHPSSGWPTFDS具有至少70 %序 列同一性，和/或與序列RASENVGDWLA具有至少70%序列同一性，和/或與序列〇311^3具有 至少70%序列同一性，和/或與序列QHYXRFPYT具有至少70%序列同一性，其中X為I或M，和/ 或與序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSRFAMSWVRQAPGRGLEWVASINNGNNPYYARSVQYRFTV SRDVSQNTVSLQMNNLRAEDSATYFCAKDHPSSGWPTFDSWGPGTLVTVSS 具有至少70 % 序列同一性，和/ 或與序列 DIQLTQSPSALPASVGDRVSITCRASENVGDWLAWYRQKPGKAPNLLIYKTSILESGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPDDFATYYCQHYXRFPYTFGQGTKLEIKRTV具有至少70 % 序列同一性，其中 X為 I 或Μ。
[0035] 23.依照項1-22任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物或 核酸序列或其功能性等同物，其用作藥物和/或預防劑。
[0036] 24.依照項1-22任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物或 核酸序列或其功能性等同物，其用作藥物和/或預防劑，該藥物和/或預防劑用于至少部分 治療和/或預防革蘭氏陽性細菌相關病癥。
[0037] 25.依照項1-22任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物或 核酸序列或其功能性等同物用于制備藥物和/或預防劑的用途，該藥物和/或預防劑用于至 少部分治療和/或預防革蘭氏陽性細菌相關病癥。
[0038] 26.-種藥物組合物，其包含依照項1-22任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋 白鏈或其功能性等同物或核酸序列或其功能性等同物和藥學可接受載體、稀釋劑或賦形 劑。
[0039] 27.-種分離的或重組的抗體生成細胞，其能夠生成依照項1-18任一項的抗體或 功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物。
[0040] 28.-種用于生成依照項1-18任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能 性等同物的方法，包括提供具有依照項19-22任一項的核酸序列或功能性等同物的細胞并 容許所述細胞翻譯所述依照項19-22任一項的核酸序列或功能性等同物，由此生成所述依 照項1-18任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物。
[0041] 29.依照項28的方法，進一步包括收獲、純化和/或分離所述依照項1-18任一項的 抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或功能性等同物。
[0042] 30.依照項1-18任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物或 核酸序列或其功能性等同物用于診斷葡萄球菌感染的用途。
[0043] 31.依照項1-18任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物或 核酸序列或其功能性等同物用于檢測金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌 (S. epidermidis)的用途。
[0044] 32.依照項1-18任一項的抗體或其功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物 用于診斷葡萄球菌感染的用途。
[0045] 33. -種使用依照項1-18任一項的抗體或功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性 等同物自溶液分離金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌細菌的方法。
[0046]本發明提供能夠特異性結合處于其天然背景中的葡萄球菌屬物種的抗體、其功能 性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物。因此，它們可用于抵抗和/或預防和/或診斷與 葡萄球菌屬物種的存在有關的病癥。優選地，抵抗金黃色葡萄球菌。在一個特別優選的實施 方案中，抵抗MRSA。抵抗的另一種優選葡萄球菌屬物種是表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)〇
[0047] 表皮葡萄球菌通常是非致病性的，但是免疫系統受損的患者常常有風險發生感 染。感染常常是醫院和社區獲得的，但是它們對住院患者更加構成威脅。對表皮葡萄球菌感 染最易感的人是靜脈內藥物使用者、新生兒、老年人、和使用導管或其它人工矯正器的人。 感染與血管內裝置(心瓣膜假體、分流器、等)有關，但是也常常發生于關節假體、導管、和大 傷口。癥狀包括發熱、頭痛、疲勞、食欲缺乏和呼吸困難。
[0048] 在一個優選的實施方案中，本發明提供分離的或重組的能夠特異性結合葡萄球菌 屬物種的人抗體、其功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物。依照本發明的人抗體 和功能性部分能夠結合處于其天然背景中的葡萄球菌屬物種，使得在施用所述抗體、其功 能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物時抵抗各種葡萄球菌屬物種。所述人抗體，其 功能性部分或免疫球蛋白鏈或其功能性等同物因此特別適合于治療或預防此類葡萄球菌 屬物種所致感染。與嵌合抗體相比，所述依照本發明的人抗體、其功能性部分或免疫球蛋白 鏈或其功能性等同物更加適合于人個體的治療和/或預防用途，原因在于非人序列的缺失。 這顯著降低不利副作用的風險。
[0049] 依照本發明的一種特別優選的抗體是稱作"F1"的抗體，其具有圖1所示重鏈和輕 鏈可變域序列。如本文中使用的，術語"F1"涵蓋所有F1抗體，例如分離的或重組生成的F1。 重組生成的F1在本文中也稱作"rFl'Fl的⑶R序列對F1的抗原結合特性做出特別貢獻，它 們也描繪于圖1。抗體F1是完全人的，能夠特異性結合葡萄球菌屬物種諸如金黃色葡萄球菌 和表皮葡萄球菌，而且因此是人個體的治療用途優選的。
[0050] 重要地，抗體F1能夠在體內以及在體外結合完整細菌。因此進一步提供一種分離 的或重組的能夠特異性結合金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的人抗體或其功能性部 分。另外，抗體F1能夠結合已經在例如動物的受感染組織中生長的細菌。因此提供一種分離 的結合體內生長的金黃色葡萄球菌的抗體，其中"體內生長"定義為在金黃色葡萄球菌感染 期間在動物的受感染組織中生長。還提供一種分離的、重組的或合成的免疫球蛋白鏈或其 功能性等同物，其包含對金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌特異性的人免疫球蛋白可變 區的至少一種⑶R序列。
[0051 ]抗體的功能性部分定義為在性質上，不必在數量上，與所述抗體具有至少一種共 享特性的部分。所述功能性部分能夠與所述抗體結合相同抗原，雖然不必以相同的程度。抗 體的功能性部分優選包含單域抗體、單鏈抗體、納米抗體、unibody、單鏈可變片段(scFv)、 Fab片段或F(ab'）2片段。
[0052] 抗體的功能性部分也可以這樣制備，即通過改變抗體，使得所得化合物的至少一 種特性(優選抗原結合特性），在性質上，不必在數量上，基本相同。這以多種方式進行，例如 經由保守氨基酸替代，其中一個氨基酸殘基用另一種具有大體相似特性(大小、疏水性、等） 的殘基替代，使得總體功能很可能沒有受到嚴重影響。
[0053] 如技術人員公知的，抗體的重鏈是構成免疫球蛋白分子的兩類鏈中較大的。重鏈 包含多個恒定域和一個可變域，該可變域涉及抗原結合。抗體的輕鏈是構成免疫球蛋白分 子的兩類鏈中較小的。輕鏈包含一個恒定域和一個可變域。該可變域與重鏈的可變域一起 參與抗原結合。
[0054] 互補決定區（CDR)是重鏈可變域和輕鏈可變域中存在的高變區。抗體的重鏈和所 連接的輕鏈的CDR-起形成抗原結合位點。
[0055] 免疫球蛋白鏈的功能性等同物在本文中定義為包含免疫球蛋白鏈的至少一種CDR 序列的人造結合化合物。
[0056] 由于本發明認識到圖1所示⑶R序列提供期望結合特征，因此技術人員完全能夠生 成包含至少一種改變的CDR序列的變體。例如，應用保守氨基酸替代。也可能改變圖1所示至 少一種CDR序列以生成與F1相比具有至少一種改變的特性的變異抗體或其功能性部分。優 選地，提供如下抗體或功能性部分，其包含與圖1所示CDR序列至少70%相同的CDR序列，使 得F1的有利結合特征至少部分維持或甚至改進。優選改變圖