多重等位基因檢測的制作方法
【專利說明】多重等位基因檢測
[0001] 本申請要求于2013年3月15日提交的美國臨時專利申請序列號61/792, 202的 優先權，該臨時專利申請通過引用以其整體結合到本文中。 發明領域
[0002] 本文提供了涉及核酸檢測的技術并且特別地，但不排他地，涉及用于同時檢測多 個核酸的方法和組合物的技術。
[0003] 發明背景 單核苷酸多態性（SNPs)的檢測可用于生物醫學領域例如人類遺傳學、癌癥診斷學、藥 物遺傳學和微生物基因分型。通常，許多常見的技術用等位基因特異性引物檢測SNPs，所述 等位基因特異性引物設計為具有有效延伸特異性的SNP模板而非野生型模板或其它非靶 SNP序列。由于其特異性，相對于其它技術例如等位基因特異性探針，這類等位基因特異性 引物通常優選用于SNP檢測。然而，使用等位基因特異性引物的PCR和實時PCR方法局限 于其多重性能力，這是因為擴增產物的檢測基于與共有序列結合的探針，或基于不具有充 分區分小的核苷酸變更例如個別SNPs的能力的技術。
[0004] -些常規的解決方案使用在其:V末端包含SNP-檢測核苷酸的等位基因特異性 引物和引物特異性雜交標簽（美國專利號6, 794, 133)。然而，這項技術取決于固相技術， 并且具有危及其對于實時PCR的效用的引物特異性問題。其他常規的單體型分析解決方案 提供了使用在其3'末端包含SNP-檢測核苷酸的等位基因特異性引物的多重檢測，但SNPs 的檢測通過大小而非通過實時PCR熒光信號完成（國際專利公布號W0 2008143367)。最 后，一些現存常規技術使用通用引物序列進行多重分析，但檢測通過電泳進行，并且不提供 多重實時PCR(美國專利號6, 207, 372、5, 882, 856)。因此，在生物醫學領域存在對使用等位 基因特異性引物的多重SNPs的多重PCR檢測的需求。
[0005] 發明概述 本文提供了涉及使用等位基因特異性引物進行核酸序列多重檢測的技術。例如，提供 了用于在一個檢測反應（例如，PCR，如，實時PCR)中同時檢測多個SNPs的方法的實施方 案。在一些實施方案中，所述技術在本文中被稱為多重等位基因特異性引發檢測（Masp)和 FRET-介導的多重等位基因特異性引發檢測（F-Masp)。
[0006] 在一些實施方案中，并且隨著該技術可用在一些應用中，F-Masp相對于Masp在其 探針的使用方面提供了一種或多種優勢，在一些實施方案中，如果需要，所述探針為該技術 提供了額外的特異性。例如，在一些測定中，F-Masp減少或消除來自非特異性信號的干擾， 例如，來自非特異性引發、引物二聚體的形成和/或包含相同或相似靶序列的非靶向區（例 如，假基因）的存在。
[0007] 本文所提供的該技術允許從一個均一擴增反應檢測、鑒定和/或報告多個SNPs或 基因型。因此，該技術為臨床醫生和患者更加有效提供信息、改善測定流程并提供一種所需 的技術。
[0008] 該技術，在一些實施方案中，提供用于檢測樣品中的核酸（例如，包含BRAF基因或 部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有氨基酸置換的B-Raf蛋 白的BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置換的B-Raf 蛋白的BRAF突變的核酸）的方法，所述方法包括使包含核酸的樣品與猝滅狀態的引物接 觸；和如果引物與核酸雜交并產生擴增產物，則檢測來自可檢測狀態的引物的信號，其中檢 測到信號時，在樣品中檢測到核酸。在一些實施方案中，所述猝滅狀態的引物包含雙鏈的雙 鏈體區域。在一些實施方案中，所述信號為熒光。在一些實施方案中，所述引物包含熒光團， 并且當引物在猝滅狀態下時熒光團被猝滅劑猝滅。所述技術不限制與寡核苷酸連接的熒光 部分、猝滅劑部分和FRET對。例如，一些實施方案提供一種方法，其中熒光團為FAM、TET、 JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝滅劑為 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。
[0009] 在一些實施方案中，可檢測狀態的引物與核酸雜交；在一些實施方案中，猝滅狀態 的引物通過聚合酶摻入到核酸鏈中。在一些實施方案中，猝滅狀態的引物通過聚合酶摻入 核酸鏈中并且引物保留雙鏈的雙鏈體區域；然后，在一些實施方案中，當喪失雙鏈的雙鏈體 區域時，例如，當合成置換雙鏈的雙鏈體區域的互補鏈時引物處于可檢測狀態。
[0010] 所述技術的引物以多種形式提供。例如，在一些實施方案中猝滅狀態的引物由包 含熒光團和猝滅劑的一個寡核苷酸組成。在一些實施方案中，猝滅狀態的引物由包含熒光 團的第一寡核苷酸和包含猝滅劑的第二寡核苷酸組成，其中第一寡核苷酸與第二寡核苷酸 雜交。在一些實施方案中，未激發狀態的引物由包含熒光團的第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸組成，其中第一寡核苷酸與第二寡核苷酸雜交。
[0011] 在一些實施方案中，所述技術的引物通過聚合酶（例如，在PCR期間）或另一合成 過程摻入到核酸中。在一些實施方案中，被摻入的引物處于可檢測狀態、猝滅狀態或未激發 狀態。因此，在一些實施方案中擴增子包含可檢測狀態的引物。所述技術的引物以多種形 式提供。例如，在一些實施方案中，所述引物為莖-環引物或雙鏈線性引物。在一些實施方 案中，所述引物為等位基因特異性引物。
[0012] 在一些實施方案中，所述技術進一步包括用聚合酶和核苷酸延伸可檢測狀態的引 物，并且在一些實施方案中所述技術進一步包括進行聚合酶鏈反應，例如，在一些實施方案 中所述聚合酶鏈反應為實時聚合酶鏈反應。
[0013] 在一些實施方案中所述方法為用于檢測超過一個核酸（例如，超過一個包含BRAF 基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有氨基酸置換的 B-Raf蛋白的BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置換 的B-Raf蛋白的BRAF突變的核酸），例如，超過一個等位基因、SNP、基因、突變等的多重方 法。因此，在一些實施方案中所述方法包括使包含第二核酸的樣品與猝滅狀態的第二引物 接觸；和如果第二引物與第二核酸雜交并產生擴增產物，則檢測來自可檢測狀態的第二引 物的第二信號，其中當檢測到第二信號時，在樣品中檢測到第二核酸。
[0014] 在一些實施方案中所述技術包括使用引物和探針。例如，在一些實施方案中提供 用于檢測樣品中核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的樣品與猝滅狀態或未激發狀態的 引物和探針接觸；和如果探針與核酸雜交，則檢測來自引物的信號，其中當檢測到信號時， 在樣品中檢測到核酸。在一些實施方案中，所述探針包含雙鏈的雙鏈體區域。在一些實施 方案中，所述信號為熒光。在一些實施方案中，所述探針包含熒光團（例如，熒光共振能量 轉移供體），并且引物包含熒光團（例如，熒光共振能量轉移受體）。
[0015] 所述技術的探針以多種形式提供。例如，在一些實施方案中猝滅狀態的探針由包 含熒光團和猝滅劑的一個寡核苷酸組成。在一些實施方案中，猝滅狀態的探針由包含熒光 團的第一寡核苷酸和包含猝滅劑的第二寡核苷酸組成，其中第一寡核苷酸與第二寡核苷酸 雜交。在一些實施方案中，未激發狀態的探針由包含熒光團的第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸組成，其中第一寡核苷酸與第二寡核苷酸雜交。在一些實施方案中，探針（例如，在其Y 末端）被修飾以使其不能提供通過聚合酶來延伸的底物（例如，聚合酶不能將核苷酸加到 探針中）。在一些實施方案中所述探針為如本文所述的莖-環探針或雙鏈的線性探針。所 述技術可用于檢測等位基因、SNPs、突變等，并且在一些實施方案中所述引物為等位基因特 異性引物。
[0016] 在一些實施方案中，當探針處于猝滅狀態時，探針熒光團被猝滅劑猝滅。所述技術 不限制與所述技術的寡核苷酸連接的熒光團和猝滅劑。例如，在一些實施方案中熒光團為 FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝滅劑為 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。 在一些實施方案中，所述引物包含第二熒光團，其為與探針的熒光共振能量轉移（FRET)供 體的熒光團相容的熒光共振能量轉移（FRET)受體。
[0017] 在一些實施方案中，所述方法包括用聚合酶和核苷酸延伸引物，例如，如在進行聚 合酶鏈反應中的那樣。在一些實施方案中，聚合酶鏈反應為實時聚合酶鏈反應。
[0018] 在一些實施方案中，所述方法為用于檢測超過一個核酸（例如，超過一個包含 BRAF基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有氨基酸置 換的B-Raf蛋白的BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸 置換的B-Raf蛋白的BRAF突變的核酸），例如，超過一個等位基因、SNP、基因、突變等的多 重方法。在一些實施方案中包括使用FRET，同一供體部分與兩個（或更多個）不同的受體 部分一起使用，并且在一些實施方案中兩個（或更多個）不同的供體部分與兩個（或更多 個）受體部分一起使用。因此，在一些實施方案中所述方法進一步包括使包含第二核酸的 樣品與第二引物接觸；和如果探針與第二核酸雜交，則檢測來自第二引物的第二信號，其中 當檢測到第二信號時，在樣品中檢測到第二核酸。
[0019] 所述技術提供可用于檢測一個或多個等位基因、SNPs、基因、突變等的組合物的實 施方案。在一些實施方案中提供包含下列之一的組合物： 與可檢測引物雜交的核酸，其中所述可檢測的引物包含熒光團和猝滅劑； 包含可檢測引物的核酸，其中所述可檢測引物包含熒光團和猝滅劑； 與可檢測引物雜交的核酸，其中所述可檢測引物包含熒光團；和包含猝滅劑的猝滅劑 寡核苷酸； 包含可檢測引物的核酸，其中所述可檢測引物包含熒光團；和包含猝滅劑的猝滅劑寡 核苷酸； 包含引物并且與探針雜交的核酸，其中所述探針包含第一熒光團和猝滅劑，所述引物 包含第二熒光團，并且所述第一熒光團和第二熒光團為FRET對；或 包含引物并且與探針雜交的核酸，其中所述探針包含第一熒光團，所述引物包含第二 熒光團，并且所述第一熒光團和第二熒光團為FRET對；和包含猝滅劑的猝滅劑寡核苷酸。
[0020] 在一些實施方案中所述組合物為反應混合物。在一些實施方案中所述組合物進一 步包含聚合酶和/或核苷酸（例如，在PCR如實時PCR中）。在一些實施方案中熒光團為 FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝滅劑為 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。 一些實施方案包含超過一種焚光團和/或超過一種猝滅劑。
[0021] -些實施方案提供使用本文所提供的探針和引物，例如，多重引物（例如，等位基 因特異性引物）的組合進行兩個或更多個等位基因、SNPs、突變、基因等的多重檢測。因此， 在一些實施方案中提供用于兩個（或更多個）等位基因、SNPs、突變、基因等的多重檢測的 組合物、方法、系統和試劑盒。這些實施方案涉及如本文所述的兩個或更多個引物（例如， 兩個或更多個等位基因特異性引物）的使用，各引物用單獨的可檢測熒光團標記。在這些 實施方案中，與兩個或更多個引物相關的猝滅劑可為相同的猝滅劑或與兩個或更多個引物 相連的猝滅劑可為兩個或更多個不同的猝滅劑。在包含探針和/或使用探針的實施方案 中，與兩個或更多個引物相連的探針可為相同的探針或與兩個或更多個引物相連的探針可 為兩個或更多個不同的探針。因此，用于多重測定的探針可包含相同的序列或用于多重測 定的探針可包含兩個或更多個不同的序列（例如，與相同的靶序列雜交或與兩個或更多個 不同的靶序列雜交）。在一些實施方案中，與探針雜交的兩個或更多個不同的序列可相差僅 單個核苷酸。對于包含猝滅劑的探針的實施方案，兩個或更多個不同探針的每一個可包含 相同的猝滅劑或包含猝滅劑的兩個或更多個不同的探針的每一個可包含兩種或更多種不 同的猝滅劑。在一些實施方案中，兩個或更多個引物用于多重檢測并且一個探針用于所述 兩個或更多個引物的檢測。在一些實施方案中，兩個或更多個引物用于多重檢測并且兩個 或更多個探針用于所述兩個或更多個引物的檢測。
[0022] -些實施方案與探針上的供體熒光團與兩個或更多個引物上的兩個或更多個受 體熒光團之間的熒光共振能量轉移（例如，F-Masp)相關。在這些實施方案中，同一探針供 體熒光團與兩個或更多個引物的受體熒光團一起使用。因此，在測定中至少存在三個熒光 團，例如，第一引物上的受體熒光團、第二引物上的不同的受體熒光團和探針上的與兩個或 更多個引物熒光團的每個形成FRET對的供體熒光團。在一些實施方案中，兩個或更多個引 物的每個使用兩個或更多個不同的探針。在這些實施方案中，兩個或更多個不同的探針供 體熒光團與兩個或更多個引物受體熒光團一起使用。因此，在測定中至少存在四個熒光團， 例如，第一引物上的受體熒光團、第二引物上的不同的受體熒光團、探針上與第一引物相關 的供體熒光團和探針上與第二引物相關的不同的供體熒光團。每個相關的引物-探針對的 引物和探針熒光團為FRET對。在一些實施方案中，未雜交的探針包含雙鏈的雙鏈體區域； 在一些實施方案中未雜交的探針包含猝滅劑（例如，探針處于未激發狀態）。
[0023] 因此，在一些實施方案中（例如，多重實施方案）所述組合物進一步包含下列之 與第二可檢測引物雜交的第二核酸，其中所述第二可檢測引物包含第二熒光團和猝滅 劑或第二猝滅劑； 包含第二可檢測引物的第二核酸，其中所述第二可檢測引物包含第二熒光團和猝滅劑 或第二猝滅劑； 與第二可檢測引物雜交的第二核酸，其中所述第二可檢測引物包含第二熒光團； 包含第二可檢測引物的第二核酸，其中所述第二可檢測引物包含第二熒光團； 包含第二引物并且與探針雜交的第二核酸，其中所述探針包含第一熒光團和猝滅劑， 所述第二引物包含第三熒光團，并且所述第一熒光團與第三熒光團為FRET對；或 包含第二引物并且與探針雜交的第二核酸，其中所述探針包含第一熒光團，所述第二 引物包含第三熒光團，并且所述第一熒光團與第三熒光團為FRET對。
[0024] 在一些包含猝滅劑寡核苷酸的實施方案中，所述猝滅劑寡核苷酸為包含猝滅劑或 第二猝滅劑的第二猝滅寡核苷酸。相關的實施方案提供如本文所提供的組合物用于檢測一 個或多個等位基因、檢測一個或多個單核苷酸多態性和/或在多重測定中檢測同一樣品中 的超過一個等位基因的用途。
[0025] 進一步的實施方案提供包含（例如，用于檢測核酸（例如，包含BRAF基因或部分 BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突變的核酸，如，包含編碼含有氨基酸置換的B-Raf蛋白的 BRAF突變的核酸，例如，包含編碼含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置換的B-Raf蛋 白的BRAF突變的核酸）的）檢測試劑的試劑盒，其中所述檢測試劑包含下列之一： 包含熒光團和猝滅劑的莖-環引物； 包含含有熒光團的等位基因特異性單鏈引物和互補的猝滅寡核苷酸的雙鏈線性引 物； 包含含有熒光團的等位基因特異性單鏈引物和互補寡核苷酸的雙鏈線性引物； 包含熒光團的等位基因特異性引物和包含含有第二熒光團的探針鏈和猝滅劑寡核苷 酸的雙鏈探針； 包含熒光團的等位基因特異性引物和包含含有第二熒光團的探針鏈的雙鏈探針；或 包含熒光團的等位基因特異性引物和包含第二熒光團和猝滅劑的莖-環探針。
[0026] 在一些實施方案中，所述試劑盒進一步包含對照核酸。
[0027] 在一些實施方案中，所述試劑盒提供超過一個等位基因、SNP、基因、突變等的多重 檢測。因此，在一些實施方案中所述試劑盒進一步包含第二檢測試劑，其中所述第二檢測試 劑包含下列之一： 包含第二熒光團和猝滅劑或第二猝滅劑的第二莖-環引物； 包含含有第二熒光團的第二等位基因特異性單鏈引物和互補的猝滅寡核苷酸或第二 互補的猝滅寡核苷酸的第二雙鏈線性引物；或 包含第三熒光團的第二等位基因特異性引物。
[0028] 試劑盒包含探針，在一些實施方案中，例如： 包含含有第四熒光團的第二探針鏈和猝滅劑寡核苷酸的第二雙鏈探針； 包含含有第四熒光團的第二探針鏈和第二猝滅劑寡核苷酸的第二雙鏈探針； 包含第四熒光團和猝滅劑的第二莖-環探針；或 包含第四熒光團和第二猝滅劑的第二莖-環探針。
[0029] 在一些實施方案中，包含第二等位基因特異性引物的試劑盒還包括：包含含有第 二熒光團的探針鏈和猝滅劑寡核苷酸的雙鏈探針（例如，同樣與第一等位基因特異性引物 一起使用的探針）。在一些實施方案中，包含第二等位基因特異性引物的試劑盒還包括：包 含含有第二熒光團的探針鏈的雙鏈探針（例如，同樣與第一等位基因特異性引物一起使用 的探針）。
[0030] 如上所述，在一些實施方案中，所有的探針均包含與每個引物受體熒光團的熒光 團形成FRET對的相同供體熒光團。在一些實施方案中，不同的引物-探針對使用不同的受 體-供體FRET對。因此，在一些實施方案中熒光團與第二熒光團為FRET對，第三熒光團與 第二熒光團為FRET對，或第三熒光團與第四熒光團為FRET對。
[0031] 因此，本文提供用于檢測樣品中核酸的方法的實施方案，所述方法包含使包含核 酸的樣品與猝滅狀態的探針接觸；和如果引物與核酸雜交或引物與核酸雜交并且引物摻 入到擴增子中，則檢測來自可檢測狀態的引物的信號，其中所述核酸包含BRAF基因或部分 BRAF基因并且當檢測到信號時在樣品中檢測到核酸。在一些實施方案中，猝滅狀態的引物 包含雙鏈的雙鏈體區域。在一些實施方案中，所述信號為熒光。在一些實施方案中，所述 引物包含熒光團，并且當引物處于猝滅狀態時熒光團被猝滅劑猝滅。在一些實施方案中，熒 光團為 FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5