用于生物分子檢測的催化性核酸和金納米粒子的制作方法

用于生物分子檢測的催化性核酸和金納米粒子的制作方法
【技術領域】
[0001] 本公開涉及生物分子檢測領域。更具體地，本發明涉及使用催化性核酸分子和金 納米粒子檢測樣品中革E (target)生物分子的方法。
【背景技術】
[0002] 簡單的、具有成本效益的、靈敏的和特異的照護現場（point-of-care，P0C)診斷學 的開發代表了 21世紀的重大挑戰。[1]感染性疾病的傳播造成了全球經濟和生活的巨大 損失。控制疾病的傳播的方法是早期在P0C檢測病原體，以及施行適當的治療或隔離。[2] 作為生物標記物的DNA的檢測是目前廣泛使用的病原檢測的技術。[3]實時熒光定量核酸 擴增檢測系統（qPCR)是精選的方法，因為它包括酶信號擴增（amplification)步驟以實現 遺傳革G標（genetic target)的高度靈敏和特異性檢測。[4]然而，qPCR需要昂貴的設備和 受過高級訓練的人員，限制了對于醫學實驗室的技術使用。強烈需要開發更便宜且更簡單 的用于檢測DNA靶標和/或其它生物靶標的方法[5]。
[0003] DNA酶（DNAzyme)是一種合成的DNA酶（DNAenzyme)，其能夠催化另一種核酸分子 的裂解（cheavage)。[6-8]由于利用了多個代謝回轉（turnover)來進行催化，所以DNA酶 將酶擴增步驟引入到實驗設置中。[9]該擴增不需要昂貴的且具有低熱和儲存穩定性的蛋 白質成分而進行。雖然最初設計用來檢測Pb2+和其它二價陽離子，[10-19]但已經報導了 允許DNA酶檢測生物分子靶標的若干修改。[9，20-27]使用兩種主要的方法來實施遺傳 革巴標的檢測。第一種方法利用類過氧化物酶的DNA酶（peroxidase-mimicking DNAzyme)的 競爭性活化，該類過氧化物酶的DNA酶能夠促進比色或化學發光產物的產生。[28]在第二 種更靈敏的方法中，多個團隊遵循相似的策略通過將DNA酶分裂成無活性的成分以實施遺 傳靶標的檢測，該無活性的成分能夠通過靶標結合而再活化。[9，23-25，29]然而，這些 研究利用熒光作為讀數（readout)，該讀數對于P0C應用不是最佳的檢測模式，因為它需要 使用相當復雜的熒光計裝置。已經報導了一種可供選擇的利用金納米粒子（GNP)的比色讀 數的方法用于金屬離子、腺苷和可卡因的檢測。[10-14，16-18，20，21]GNP吸收光的波長 取決于它們是處于單分散還是聚集狀態。[30]由于處于單分散或聚集狀態的GNP溶液以 它們各自的紅色或紫色是容易辨識的，所以這種方法提供了能夠肉眼可視的清楚的比色結 果。[31] 照此，發明的目的是通過將DNA酶技術與GNP結合以策劃能夠用于遠程設置的簡單的 照護現場診斷平臺，以克服上述限制[32，33]。
[0004] 發明的進一步和其它目的將會從下面的
【發明內容】
、發明討論及其實施方案和實施 例得以了解。

【發明內容】

[0005] 本發明涉及擴增金納米粒子的表面等離子體與DNA酶信號擴增技術結合的比色 偶合（coupling)，以策劃具有簡單的比色讀數的用于遺傳靶標的快速且簡單的檢測平臺。 本公開的創造性包括這兩種用于生物靶標的檢測的新興技術的融合，其可以用于感染性疾 病靶標的照護現場分析。
[0006] 照此，在一個實施方案中，本發明提供一種檢測樣品中生物靶標的存在的方法。 在一個實施方案中，該方法包括：(a)將所述樣品與下列項接觸：Q)未催化的核酸底物 (substrate)，（ii)催化性核酸，所述催化性核酸經配置以在所述祀標的存在下單獨地催化 所述底物，及（iii) GNP，所述GNP用連接部分官能化，以與所述未催化的核酸底物組裝；以 及（b)分析所述樣品以確定所述GNP是處于實質上分散的形式還是處于與所述未催化的 核酸底物組裝的形式，其中所述GNP處于實質上分散的形式表明所述靶標存在于所述樣品 中。
[0007] 在用于檢測樣品中生物靶標的方法的一個實施方案中，在合適的溫度下在足量時 間內首先將（i)和（ii)添加到所述樣品中，然后將（iii)添加到所述樣品中。
[0008] 在用于檢測樣品中生物靶標的方法的另一個實施方案中，所述催化性核酸以預催 化性核酸亞單位形式提供，每個預催化性核酸亞單位包括經配置以結合到所述靶標的至少 部分上的傳感器域（sensor domain)，及當所述祀標結合到所述傳感器域上時單獨地催化 所述未催化的核酸底物的催化域（catalytic domain)。
[0009] 在用于檢測樣品中生物靶標的方法的另一個實施方案中，所述GNP用核酸鏈官能 化，該核酸鏈與用于組裝的所述未催化的核酸底物的3'末端和5'末端雜交。
[0010] 在用于檢測樣品中生物靶標的方法的另一個實施方案中，在所述組裝的形式下， 所述GNP將所述樣品變成第一顏色，且在所述實質上分散的形式下，所述GNP將樣品變成第 二顏色，并且其中所述方法的步驟（b)包括確定所述樣品的顏色。檢測到第二顏色表明所 述樣品中靶標的存在。
[0011] 在用于檢測樣品中生物靶標的方法的另一個實施方案中，所述未催化的核酸底 物、所述催化性核酸和所述GNP經官能化而成為祀特異性的（target specific)。
[0012] 在一個實施方案中，本發明提供一種同時檢測樣品中關注的多種不同生物靶標的 存在的方法。在一個實施方案中，所述方法包括：(a)將懷疑具有多種不同生物靶標的樣 品與（i)靶特異性的未催化的核酸底物和（ii)靶特異性的催化性核酸的靶特異性的組 (sets)混合，在每個靶特異性的組中的所述催化性核酸經配置以在靶標的存在下單獨地催 化所述未催化的底物；(b)將步驟（a)的混合物與單獨的祀特異性的GNP群（populations) 接觸，在每個靶特異性的群中的所述GNP用連接部分官能化，以與其相應的靶特異性的未 催化的核酸底物組裝；及（c)對于每個單獨的靶特異性的GNP群，確定所述靶特異性的GNP 是否處于與所述相應的靶特異性的未催化的底物組裝的形式或處于實質上分散的形式，其 中在一個群中所述靶特異性的GNP處于實質上分散的形式表明相應于本靶特異性的GNP群 的所述靶標存在于所述樣品中。
[0013] 在同時檢測樣品中關注的多種不同生物靶標的存在的方法的一個實施方案中，所 述催化性核酸以預催化性核酸亞單位形式提供，每個預催化性核酸亞單位包括用于特異性 結合到所述多種不同靶標中的一種上的傳感器域，及經配置以當相應的靶標與傳感器臂 (sensor arm)結合時單獨地催化其相應的祀特異性的未催化的核酸底物的催化域。
[0014] 在本發明的同時檢測樣品中關注的多種不同生物靶標的存在的方法的另一個實 施方案中，在組裝的形式下，所述GNP將所述樣品變成第一顏色，且在實質上分散的形式 下，所述GNP將所述樣品變成第二顏色，并且其中所述方法的步驟（c)包括對于每個GNP 群，確定所述樣品的顏色。在一個GNP群中檢測到所述第二顏色表明在所述樣品中本GNP 群的所述靶標的存在。
[0015] 在任何前面的實施方案的方法的一個實施方案中，所述方法進一步包括將所述樣 品滴到薄層色譜（TLC)板上，用于視覺檢測。在本實施方案的一個方面，所述方法進一步包 括儲存所述TLC，用于以后查看。
[0016] 在任何前面的實施方案的方法的另一個實施方案中，所述方法進一步包括峰值吸 光度（peak absorbance)的紫外-可見光譜位移（shift)的光譜測量。
[0017] 在任何前面的實施方案的方法的另一個實施方案中，所述催化性核酸和所述未催 化的核酸底物以凍干的混合物形式提供。
[0018] 在任何前面的實施方案的方法的另一個實施方案中，所述催化性核酸、所述未催 化的核酸底物和所述GNP以凍干的形式提供。
[0019] 在又一個實施方案中，本發明提供一種用于檢測樣品中關注的生物靶標的試劑 盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包括：(a)未催化的核酸底物，（b)在所述靶標的存在下 能夠單獨地催化所述未催化的底物的催化性核酸，及（c)用連接部分官能化以與未催化的 核酸底物組裝的GNP。
[0020] 在所述試劑盒的一個實施方案中，所述催化性核酸以預催化性核酸亞單位形式提 供，每個預催化性核酸亞單位包括以結合到所述靶標的至少部分上的傳感器域，及當所述 靶標結合到所述傳感器域上時單獨地催化所述未催化的核酸底物的催化域。
[0021] 在所述試劑盒的另一個實施方案中，與所述未催化的核酸底物組裝的GNP將樣品 變成第一顏色，并且處于實質上分散的形式的GNP將樣品變成第二顏色。
[0022] 在所述試劑盒的另一個實施方案中，所述未催化的核酸底物和所述催化性核酸為 凍干的混合物形式。
[0023] 在所述試劑盒的另一個實施方案中，所述GNP、未催化的核酸底物和所述催化性核 酸為凍干的混合物形式。
[0024] 在所述試劑盒的另一個實施方案中，所述試劑盒進一步包括催化臂的最佳活性所 需要的成分。
[0025] 在所述試劑盒的另一個實施方案中，所述試劑盒進一步包括TLC。
【附圖說明】
[0026] 現在僅通過實施例參照附圖來描述實施方案，其中： 圖1:板塊A-MNA酶催化的機理。經許可改編自[9]。版權2009美國化學學會 (Copyright 2009 American Chemical Society)。板塊 B-GNP 聚集體形成。連接肽 (linker)雜交到DNA鏈A和B上，使兩個GNP的組交聯并將溶液變成紫色。板塊C - MNA酶 試驗（assay)概要。靶活化的MNA酶降解連接肽DNA，防止GNP聚集體形成。在靶標的缺失 下，連接肽保持完整并使GNP交聯(如B中所示);溶液變成紫色。板塊D-描述該試驗將如 何在照護現場進行以并行分析多種靶標的示意圖。
[0027] 圖2 :板塊A -連接肽i濃度的最佳化。板塊B -檢測AF-1遺傳靶標的靈敏度。 對于板塊A和B-頂部：在TLC板上的比色讀數。底部：在峰值吸光度中的位移。數據以3 個重復為基礎；誤差棒是標準誤差。板塊C - 5種革E標的并行檢測：AF_1，來自淋病奈瑟菌 (Λ( ^·αοατΓΑ〇6><36>(6οη))和梅毒螺旋體（71. j〇aWii/iM?(Syph))細菌，癥疾寄生蟲惡性癥原蟲 (malarial parasite /3. 和HBV病毒的遺傳序列。檢測所有5種革巴標 (頂行)，5種靶標中的3種（中間行)，或無靶標對照(底行)。斑點顏色表明靶標存在(大的灰 色斑點）或不存在(小的黑色斑點）。調整了圖像的對比度和亮度。
[0028] 圖3 :示出了根據本發明的一個實施方案，DNA酶信號擴增與金納米粒子的表面等 離子體特性相結合以實現生物靶標的比色檢測的圖。
[0029] 圖4 :頂部：在TLC板上的比色讀數。底部：在SPR峰值吸光度中的位移。數據以 3個重復為基礎；誤差棒是標準誤差。
【具體實施方式】
[0030] 定義 在本說明書和權利要求中，將參照多個應該定義為具有下列含義的術語。所有的數字 標識（numerical designations)，例如尺寸和重量，包括范圍，都是近似值，其通常可以是 以變量0. 1、1.0或10.0 ( + )或（-)變化，視情況而定。所有的數字標識可以理解為前面 加上術語"約"。
[0031] 除非文中另有明確規定，單數形式"一（a、an和the)"包括復數指代。
[0032] 術語"包括"是指必須包括任何列舉的要素且可以任選地包括其它要素。"基本上 由……組成"是指必須包括任何列舉的要素，將實質地影響所列出的要素的基本和新穎特 性的要素排除在外，并且可以任選地包括其它要素。"由……組成"是指將除了那些列舉的 要素外的所有要素排除在外。由這些術語的每個定義的實施方案在本發明的范圍內。
[0033] "催化性核酸分子"、"催化性核酸"和"催化性核酸序列"是等同的，并且每個 應該是指特異性識別獨特的底物并促進該底物的化學改性的DNA分子或包含DNA的分 子(在本領域中也稱作"DNA酶"）或者RNA或包含RNA的分子(在本領域中也稱作"核酶 (ribozyme)")。在該DNA酶和核酶中的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T和U，及其在本領域 中公知的衍生物[PCR Systems, Reagents and Consumable