微生物的檢查方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物的檢查方法，特別是涉及適于檢測包含在壓載水等中而存活的浮游生物等微生物的微生物的檢查方法。
【背景技術】
[0002]未搭載貨物的船舶為了使該船舶穩定而搭載壓載水航行，在搭載貨物的海域將上述壓載水排出。
[0003]壓載水通常在與搭載的海域不同的海域排出，因此有可能將該壓載水所含有的浮游生物、細菌等微生物搬運至原來的棲息地以外的海域，引起破壞生態系等問題。
[0004]為了解決這樣的問題，制定與壓載水的限制有關的國際規則，通過了“用于限制并管理船舶的壓載水及沉殿物的國際條約(壓載水管理條約)”。
[0005]就與上述壓載水管理條約相關的“關于壓載水采樣的指標(G2)”而言，在“壓載水排出基準(D-2)”中，將從船舶排出的壓載水所含有的存活的微生物的允許個體數根據所述微生物的最小尺寸區分而規定的，例如，關于最小尺寸50μπι以上的微生物(以下，稱為“L尺寸生物” ο)，規定為10個/m3以下，關于最小尺寸為ΙΟμ??以上且小于50μηι的微生物(以下，稱為“S尺寸生物”。)，規定為10個/mL以下。
[0006]目前為止，作為排出上述壓載水時用于確認是否滿足上述排出基準的方法，已知如下微生物檢查裝置:專利文獻1所記載的使以送水栗抽取的海水通過流動池而測量圖像的微生物檢查裝置專利文獻2所記載的使以送水栗抽取的海水通過網眼不同的濾波器單元，使濾波器上的微生物發光，計算微生物的微生物檢查裝置等。
[0007]上述專利文獻1所記載的微生物檢查裝置，包含:染色部，在使液體檢測物流動的同時，使存在于該檢測物中具有活細胞的生物染色;濃縮部，在使所述經施行染色的檢測物流動的同時，進行濃縮，以提高所述生物的濃度;個體測量部，取得所述經濃縮的檢測物中包含所述生物的個體的圖像信息；及控制機構，根據由所述個體測量部輸出的所述個體的圖像信息，測定該生物。
[0008]由此，可以以流動方式進行檢測物液體中生物的染色工序、液體中生物的濃縮工序，液體中生物的信息獲取的工序等，因此與以分批方式進行各方式的方法相比，能夠大幅縮短一個工序結束的檢測物的一部分進展至下一個工序為止的待機時間，或使其為0，防止在待機時間染色的狀態劣化，從該意義來講，具有能夠穩定取得生物生死的信息的優點。
[0009]然而，上述專利文獻1所記載的微生物檢查裝置，使由送水栗抽取的海水依次通過各種工序，從而存在裝置龐大、且制造成本高的問題。此外，雖然依次通過各種工序而縮短待機時間，但存在直到測定結束為止至少需耗費數小時這樣的問題。
[0010]此外，上述專利文獻2所記載的微生物檢查裝置的特征在于，具備如下工序:使海水通過將網眼不同的3種濾波器串聯配置而成的濾波器單元的工序;產生由濾波器捕獲且存活的微生物造成的發色、發光及熒光中任一者的工序;及檢測發色、發光及熒光中任一者，利用圖像分析計算壓載水或海水中的微生物數的工序。
[0011]由此，能夠實現階段性地捕捉每一尺寸的微生物，其結果，具有能夠迅速測定是否滿足按每一尺寸的基準限制的允許殘存基準這樣的優點。
[0012]然而，專利文獻2所記載的微生物檢查裝置也與專利文獻1同樣，使以送水栗抽取的海水依次通過各種工序，從而具有裝置龐大、制造成本高的問題。
[0013]在此，鑒于上述問題，本申請人通過專利文獻3提出一種微生物的檢查方法，該微生物的檢查方法通過利用分批式的測定池，能夠簡便地且在短時間內，并以高精度測定壓載水中微生物的量。
[0014]本申請人提出的微生物的檢查方法具備:攪拌混合工序，在分批式的試樣容器內，將試樣中添加有熒光染色試劑的試樣溶液攪拌、混合;激發工序，在攪拌所述試樣溶液的同時，對所述試樣容器的被照射面照射激發光;受光工序，對通過所述激發光而熒光發光的微生物的熒光進行計數;及微生物數推定工序，根據通過該受光工序檢測的發光數，計算試樣容器中試樣所含有的微生物量。
[0015]由此，具有如下作用、效果:能夠在極短時間內使微生物明亮地發光，簡便地且在短時間內測量壓載水中微生物的量，且由于熒光發光的厚度部分薄，因此背景與微生物的熒光發光的光量差非常明確，能夠提高微生物熒光發光的檢測精度。
[0016]作為上述微生物的檢測原理，例如圖6所示，利用光電增倍管，以電信號檢測熒光染色的浮游生物等微生物，將連續檢測到的例如約0.9V的電壓的背景成分與存活的浮游生物通過的熒光強度進行比較，能夠根據浮游生物通過時熒光強度的峰的高度、即電壓的高度，與背景成分區別。在此，所謂背景成分，是指樣品水本身的熒光即自身的熒光、染色劑在樣品水中自然分解而發出熒光。
[0017]然而，就上述提出的方案而言，存在隨著背景成分增大，干擾成分也變大的傾向，其結果，背景成分增大后S/N比降低，存在對檢測精度造成影響這樣的問題。
[0018]現有技術文獻
[0019]專利文獻
[0020]專利文獻1:日本特開2009 — 85898號公報
[0021]專利文獻2:日本特開2007 —135582號公報
[0022]專利文獻3:日本特開2014 — 042463號公報
【發明內容】
[0023]發明所要解決的課題
[0024]鑒于上述問題，本發明的技術課題在于提供一種微生物的檢測方法，其能夠減少背景成分的熒光發光而提高檢測精度。
[0025]用于解決課題的方法
[0026]根據本發明的微生物的檢查方法，用于測定試樣中的微生物量，所述試樣中的微生物量的測定包括:將試樣及熒光染色試劑攪拌、混合來調制試樣的試樣調制工序;及根據對所述試樣照射特定波長的激發光而獲得的熒光發光的發光數來計算微生物量的微生物量計算工序，所述試樣調制工序包括:將一定量的試樣及所述熒光染色試劑攪拌、混合的熒光染色工序;將該熒光染色工序后的溶液靜置一定時間的靜置工序;及以不發出熒光的液體稀釋該靜置工序后的溶液的稀釋工序。
[0027]在所述熒光染色工序中，可以向試樣容器投入該試樣容器整體容積的1?10%容量的試樣，且向所述試樣容器中投入相對于所述試樣1容量為1%容量的熒光染色試劑，并攪拌、混合。進而，作為所述熒光染色試劑，也可以使用Π)Α，并添加至其在稀釋前試樣中的濃度為0.0lmM。
[0028]根據本發明的微生物的檢查方法，用于測定試樣中的微生物量，所述試樣中的微生物量的測定包括:試將試樣及熒光染色試劑攪拌、混合來調制試樣的試樣調制工序;及根據對所述試樣照射特定波長的激發光而獲得的熒光發光的發光數來計算微生物量的微生物量計算工序，所述試樣調制工序包括:將一定量的試樣及所述熒光染色試劑攪拌、混合的熒光染色工序;將該熒光染色工序后的溶液靜置一定時間的靜置工序;及向該靜置工序后的溶液中添加pH調節劑的pH調節工序。在所述pH調節工序中，也可以在所述熒光染色工序的溶液的pH為8.0時，在該pH調節工序中添加pH調節劑，以使pH為6.0。
[0029]發明的效果
[0030]根據本發明的微生物的檢查方法，首先，在熒光染色工序中將熒光染色試劑與少量的試樣攪拌、混合，接著，在靜置工序中靜置溶液一定時間，進而在稀釋工序中以不發出熒光的液體稀釋。由此，在所述熒光染色工序中攪拌、混合少量的試樣中所含有的微生物與熒光染色試劑，以幾乎沒有不均的狀態確實染色，在所述稀釋工序中添加稀釋液時，熒光染色試劑的染色活性度已不起作用，在最終工序的微生物量計算工序中，能夠減少背景成分的熒光發光，提高S/N比，顯著提高檢測精度。在此，如果在所述熒光染色工序中，向試樣容器中投入該試樣容器整體容積的1?10%容量的試樣，且向所述試樣容器中投入相對于所述試樣1容量為1%容量的熒光染色試劑，并攪拌、混合，則能夠進一步提高檢測精度。進而，作為熒光染色試劑，使用FDA，并添加至其在稀釋前試樣中的濃度為0.0lmM時有效。
[0031]此外，本發明的微生物的檢查方法中，所述試樣調制工序包括:將一定量的試樣及所述熒光染色試劑攪拌、混合的熒光染色工序;將該熒光染色工序后的溶液靜置一定時間的靜置工序；向該靜置工序后的溶液中添加pH調節劑的pH調節工序，例如在熒光染色工序中試樣的pH若為弱堿性，則試樣中所含有的微生物與熒光染色試劑被攪拌、混合，以幾乎沒有不均的狀態確實染色，在該pH調節工序中添加pH調節劑而試樣的pH為弱酸性時，熒光染色試劑的染色活性度已不起作用，在最終工序的微生物量計算工序中，能夠減少背景成分的熒光發光，提高S/N比，顯著提高檢測精度。此時，如果在所述pH調節工序中，在所述熒光染色工序的溶液的pH為8.0時，在該pH調節工序中添加pH調節劑，以使pH為6.0，則能夠進一步提尚檢測精度。
【附圖說明】
[0032]圖1是第1實施例的微生物的檢查方法的概略工序圖。
[0033]圖2是第2實施例的微生物的檢查方法的概略工序圖。
[0034]圖3是應用于微生物的檢查方法的檢查裝置的概略圖。
[0035]圖4(a)?(b)是顯示背景成分中，未稀釋者的一例的電壓波形圖。
[0036]圖5(a)?(b)是顯示背景成分中，稀釋者的一例的電壓波形圖。
[0037]圖6是顯示比較以往的背景成分與存活的浮游生物通過的熒光強度的電壓波形圖。
【具體實施方式】
[0038]圖1是第1實施例的微生物的檢查方法的概略工序圖，圖2是第2實施例的微生物的檢查方法的概略工序圖。
[0039]如圖1及圖2所示，微生物的檢查方法包括:試樣調制工序，采集壓載水作為試樣，將該試樣與熒光染色試劑攪拌、混合，調制試樣;及微生物量計算工序，使用微生物檢查裝置1，根據對試樣調制工序調制的試樣照射特定波長的激發光而獲得的熒光發光的發光數，計算微生物量。
[0040]本發明的第1實施例中，所述試樣調制工序包括:熒光染色工序，將一定量的試樣及該熒光染色試劑攪拌、混合;靜置工序，將該熒光染色工序后的溶液靜置一定時間；及稀釋工序，以不發出熒光的液體稀釋該靜置工序后的溶液。
[0041]此外，在第2實施例中，所述試樣調制工序包括:熒光染色工序，將一定量的試樣及所述熒光染色試劑攪拌、混合;靜置工序，將該熒光染色工序后的溶液靜置一定時間；及pH調節工序，向該靜置工序后的溶液中添加pH調節劑。
[0042]參照圖1說明第1實施例的試樣調制工序。操作人員預先準備例如容積為100ml的試樣容器2，該試樣容器2由例如玻璃、石英、丙烯酸樹脂等透射光的