中和IL-1β的人單克隆抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗原結合蛋白，且具體涉及IL-Ιβ抗原結合蛋白。更具體地，本發明涉 及所述結合蛋白的序列及重鏈和輕鏈。本發明還提供了包含該抗原結合蛋白的組合物、該 抗原結合蛋白的應用及制備方法。
[0002] 發明背景
[0003] 白介素細胞_1β( IL-Ιβ)是白介素細胞-1細胞因子家族的成員，并且是炎癥反應的 重要介質。其為促炎癥細胞因子，且參與細胞增殖、分化和凋亡。
[0004] IL-Ιβ的過表達與許多炎性疾病和自身免疫疾病有關，如冷吡啉相關的周期性綜 合征和相關病癥、糖尿病、克羅恩氏病、類風濕性關節炎、腎細胞癌、痛風和炎性痤瘡。
[0005] 本發明一個目的是提供對IL-Ιβ具有特異性的抗原結合蛋白，其能夠中和IL-Ιβ的 活性，以預防或治療與IL-Ιβ產生升高相關的疾病。
[0006] 目前，已有靶向IL-Ιβ信號轉導通路的3種生物制劑被批準用于臨床應用：阿那白 滯素(anakinra)(IL-l受體詰抗劑）、利納西普(rilonacept)(包含IL-1受體1的融合蛋白） 和卡那單抗(canakinumab)(單克隆抗體）。
[0007] 除了以上所述的3種批準的IL-1阻滯劑，目前人源化單克隆抗體X0MA-052 (gevokizumab)處在臨床研發中。每種分子均表現出獨特的作用機制并展現不同的交叉反 應性和藥理特性。
[0008] 發明概述
[0009] 根據第一個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其包含選自以下結合 單元的一個或多個結合單元：
[0010] (i)結合單元L1，包含SEQ ID N0:3的Kabat殘基23-35或SEQ ID N0:4、15或 16的 Kabat殘基24-33或它們的變體，所述變體在所述結合單元L1中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失；
[0011] (ii)結合單元L2,包含SEQ ID N0:3的Kabat殘基51-57或SEQ ID N0:4、15或 16的 Kabat殘基49-55或它們的變體，所述變體在所述結合單元L2中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失；
[0012] (iii)結合單元L3，包含SEQIDN0:3的Kabat殘基92-102或SEQIDN0:4、15或16 的Kabat殘基88-96或它們的變體，所述變體在所述結合單元L3中含有至少一個氨基酸替 換、插入或缺失；
[0013] (iv)結合單元H1，包含SEQ ID N0:1 的Kabat殘基31-35或SEQ ID N0:2或 14的 Kabat殘基31-35或它們的變體，所述變體在所述結合單元H1中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失；
[0014] (v)結合單元H2,包含SEQ ID NO: 1 的Kabat殘基50-66或SEQ ID N0: 2或 14的Kabat 殘基50-65或它們的變體，所述變體在所述結合單元H2中含有至少一個氨基酸替換、插入或 缺失;和
[0015] (vi)結合單元H3,包含SEQ ID N0:1 的Kabat殘基99-114或SEQ ID N0:2或 14的 Kabat殘基98-108或它們的變體，所述變體在所述結合單元H3中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失。
[0016]根據第二個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其在細胞刺激檢測中 以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于3nM、小于InM、小于0.5nM或小于0.2nM的 IC50 值中和 IL-Ιβ。
[0017]根據第三個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其在細胞抑制檢測中 以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于InM、小于0.5nM或小于 0.4nM的IC50值抑制IL-1 β誘導的IL-6產生。
[0018] 根據第四個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其以小于ΙΟηΜ、小于 5nM、小于2nM、小于InM、小于0.5nM，或小于O.lnM的Kd值結合IL-Ιβ。
[0019] 根據第五個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其以1-lOOpM的IC50 值中和人IL-Ιβ。
[0020] 根據第六個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其以ΙΟΟ-ΙΟΟΟρΜ的 IC50值中和鼠 IL-Ιβ。
[0021] 根據第七個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其中所述結合蛋白對 人IL-Ιβ具有1-100ρΜ的親和力(KD)。
[0022] 根據第八個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結合蛋白，其中所述結合蛋白對 鼠 IL-Ιβ具有5-200pM的親和力(KD)。
[0023]根據第九個方面，提供了前述方面中任一方面的分離的抗原結合蛋白在治療癌 癥、炎性疾病或自身免疫疾病中的應用，所述炎性疾病或自身免疫疾病選自：關節炎、炎性 腸道疾病、克羅恩氏病、類風濕性關節炎、痛風、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相關的周期性綜 合征和炎性痤瘡。
[0024] 根據第十個方面，提供了如以上所定義的分離的抗原結合蛋白在制備用于治療癌 癥、炎性疾病或自身免疫疾病的藥物中的應用，所述炎性疾病或自身免疫疾病選自：關節 炎、炎性腸道疾病、克羅恩氏病、類風濕性關節炎、痛風、糖尿病、葡萄膜炎、冷_林相關的周 期性綜合征和炎性痤瘡。
[0025] 根據第十一個方面，提供了組合物，其包含如以上所定義的抗原結合蛋白和藥學 上可接受的載體。
[0026] 根據第十二個方面，提供了分離的細胞系，其能夠產生如以上所定義的抗原結合 蛋白。
[0027]根據第十三個方面，提供了分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2或14或它們的片段的序列或由其組成。
[0028]根據第十四個方面，提供了分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、15或16或它們的片段的序列或由其組成。
[0029]根據第十五個方面，提供了包含如以上所定義的核酸分子的載體。
[0030]根據第十六個方面，提供了包含如以上所定義的核酸分子的宿主細胞。
[0031 ]根據第十七個方面，提供了包含如以上所定義的載體的宿主細胞。
[0032]根據第十八個方面，提供了制備如以上所定義的抗原結合蛋白的方法，包括在合 適的條件下培養如以上所定義的宿主細胞，以及從中回收所述蛋白。
[0033] 根據第十九個方面，提供了治療癌癥、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述炎性 疾病或自身免疫疾病選自：關節炎、炎性腸道疾病、克羅恩氏病、類風濕性關節炎、痛風、糖 尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相關的周期性綜合征和炎性痤瘡，其中將如以上所定義的分離的抗 原結合蛋白給予至對象。
[0034] 定義
[0035]本文所用的以下詞語和術語應具有如下所表明的含義：
[0036]如本文所用，術語"抗原結合蛋白"是指抗體、抗體片段和其他蛋白構建體如結構 域，其能夠結合IL-Ιβ。
[0037] 如本文所用，術語"抗體"在廣義上是指具有免疫球蛋白樣結構域的分子，并且包 括單克隆、重組的、多克隆、嵌合的、人源化的、雙特異性、多特異性和異源綴合抗體;單個可 變結構域、結構域抗體、抗原結合片段、免疫有效片段、單鏈Fv、雙價抗體、Tandabs?等(關于 替代性"抗體"形式的綜述，參見 Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005， Vol23,No.9,1126-1136)〇
[0038] 詞語"單個可變結構域"是指特異性結合抗原或表位的抗原結合蛋白可變結構域 (例如，￥^^、1)，其與不同的可變區或結構域無關。
[0039] "結構域抗體"或"dAb"可看做與"單個可變結構域"相同，其能夠結合抗原。單個可 變結構域可為人抗體可變結構域，但還包括來自其他物種的單個抗體可變結構域，如嚙齒 類(例如，公開于W0 00/29004中的）、護士鯊和駱駝科的VHH dAb。駱駝科的Vhh為免疫球蛋白 單個可變結構域多肽，其來源的物種包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝(guanaco)， 其產生天然缺少輕鏈的重鏈抗體。這類Vhh結構域可根據本領域中可用的標準技術進行人源 化，且這類結構域被看做"結構域抗體"。如本文所用，VH包括駱駝科的Vhh結構域。
[0040] 如本文所用，術語"結構域"是指這樣的折疊蛋白結構，其具有獨立于蛋白的其余 部分的三級結構。通常，結構域負責蛋白的離散的功能特性，并且在很多情況下可被添加、 移除或轉移至其他蛋白，而不失去該蛋白的剩余部分和/或該結構域的功能。"單個可變結 構域"是折疊的多肽結構域，其包含具有抗體可變結構域特性的序列。因而，其包括完整的 抗體可變結構域和修飾的可變結構域，例如，其中一個或多個環已經被不具有抗體可變結 構域特性的序列替代，或已經被截短或包含N或C末端延伸的抗體可變結構域，以及至少保 留全長結構域的結合活性和特異性的可變結構域的折疊片段。結構域可結合抗原或表位， 而與不同可變區或結構域無關。
[0041] 可通過在非抗體蛋白骨架如結構域上排列一個或多個CDR的方式來提供抗原結合 片段。該結構域可為結構域抗體，或者可為這樣的結構域，其為選自以下的骨架的衍生物： CTLA-4(Evibody );脂質運載蛋白；蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-結構域（親和體 (八打:113〇(15〇,3卩八）、八-結構域(八￥；[11161'/]\^叉;[130(150;熱休克蛋白如61'(^1和61'(^3;轉鐵蛋白 (Trans-body);錨蛋白重復蛋白（DARPin);肽適體;C-型凝集素結構域（四連接素）；人γ -晶 體蛋白和人泛素 (aff ilin) ;Η)Ζ結構域;人蛋白酶抑制劑的蝎毒素 Kunitz型結構域;和纖連 蛋白（adnectin);其已經接受蛋白質改造以便獲得對除其天然配體以外的配體的結合。 [0042] CTLA_4(細胞毒性T淋巴細胞相關的抗原4)是主要表達于⑶4+T-細胞上的⑶28-家 族受體。其胞外結構域具有可變結構域樣Ig折疊。對應于抗體的CDR的環可用異源序列替代 以賦予不同的結合特性。經改造的具有不同結合特異性的CTLA-4分子也稱為Evibody。詳情 參見，Journal of Immunological Methods 248(1-2)，31_45(2001)〇[0043]脂質運載蛋白為胞外蛋白家族，其轉運小疏水分子，如類固醇、后膽色素類、類維 生素 A和脂類。它們具有在錐形結構的開口端帶有多個環的剛性β_折疊二級結構，其可經改 造以結合不同的革G抗原。Anticalin的大小為160-180個氨基酸，且源自脂質運載蛋白。詳情 參見，Biochim BiophysActa 1482:337-350(2000)、US7250297B1 和US20070224633。
[0044] 親和體是源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的骨架，其可經改 造以結合抗原。該結構域由約58個氨基酸的三螺旋束組成。已經通過表面殘基的隨機化生 成了文庫。詳情參見，Protein Eng.Des.Sel. 17,455-462(2004)和EP1641818A1。
[0045] Avimer是源自A-結構域骨架家族的多結構域蛋白。約35個氨基酸的天然