基于滾環擴增技術的檢測半乳糖的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物化學、分子生物學、糖類成分確認的檢測方法，具體涉及一種基于 滾環擴增技術的檢測半乳糖的方法。
【背景技術】
[0002] 半乳糖是自然界生物體內存在的一種重要的單糖，是生物體重要的營養物質之 一，在體內是糖蛋白糖鏈的組成之一，也存在于日常生活的很多的奶制品中，包括食品、飲 料、保健品、微生物發酵產品等。
[0003] 半乳糖與健康關系密切，半乳糖血癥（galactosemia)是半乳糖相關的一種常見 的常染色體隱形遺傳的遺傳代謝病（inheritedmetabolicdisorders,IMD)，是半乳糖代 謝相關酶缺陷引起的血中半乳糖濃度增尚，從而造成多器官受損的的中毒性臨床代謝綜合 征。該病患者多為嬰幼兒，進食含乳糖的奶制品后，血液和尿液中的半乳糖濃度升高，可出 現嘔吐、腹瀉、嗜睡等癥狀，半乳糖聚集于各組織中造成多器官受累，引起包括低血糖、肝硬 化、蛋白尿、白內障、智力障礙等癥狀，嚴重可至肝衰竭、感染乃至死亡。雖然該病病情危害 嚴重，但是及早發現并給與積極干預措施，能夠顯著改善預后效果。因此，準確診斷技術對 于半乳糖血癥的預防和治療十分重要，而該病的定性診斷有賴于血中半乳糖濃度的測定。
[0004] 檢測半乳糖的常用方法有高壓液相（HPLC)、液相串聯質譜（LC-MS/MS)、傅里葉變 換遠紅外光譜（FTIR)等分析化學方法。雖然這些方法有較高的檢測準確性和檢測靈敏度， 但是需要分離純化等樣品處理設備，而且所需的專業大型儀器不易普及。生物學方法有細 菌抑制試驗，包括Guthrie法利用轉移酶活性缺陷株大腸桿菌，以及Paigen法結合菌體 裂解大腸桿菌，用來檢測半乳糖的含量，然而變異菌株易產生不穩定結果，而且細菌培養耗 時費力。
[0005] 此外，對于半乳糖血癥，雖然還可以通過酶學和基因檢測，進行突變診斷，然而，現 有的酶學檢測尚不能進行有效的信號擴增，易受干擾，而且基因診斷費用較高，眾多的突變 位點也造成了其診斷的不確定性。因此，開發一種新的便捷、快速、準確的檢測半乳糖的方 法，對于半乳糖血癥的快速診斷、食品安全監測、食品化工生產等領域都有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明針對上述現存的技術問題而提出一種基于滾環擴增技術的全新的檢測半 乳糖的方法，該方法原理是結合半乳糖操縱子的阻遏蛋白和滾環擴增，通過該方法可以實 現半乳糖的簡便、快捷、可定量的檢測。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] -種基于滾環擴增技術的檢測半乳糖的方法，其特征在于：首先制備出由環形單 鏈模板DNA與線性單鏈引物DNA所形成的雙鏈結構，該雙鏈含有半乳糖阻遏蛋白的識別結 合序列，待檢測的半乳糖與半乳糖阻遏蛋白結合，結合了半乳糖的半乳糖阻遏蛋白失去了 識別并結合由環形單鏈模板DNA與線性單鏈引物DNA形成的雙鏈上的特異性識別序列的能 力，不能與該特異性識別序列結合，使DNA聚合酶能夠對線性單鏈引物DNA進行延伸和滾環 擴增，滾環擴增反應的效率與半乳糖的濃度成正比，通過比對半乳糖濃度與滾環擴增效率 的標準曲線，從而確定出待測樣品中的半乳糖含量。
[0009] 所述的待檢測的半乳糖是半乳糖溶液，濃度為1~50μM。
[0010] 所述的半乳糖阻遏蛋白是細菌產生的具有調控半乳糖操縱子表達活性的半乳糖 阻遏蛋白，該半乳糖阻遏蛋白能夠特異性地結合半乳糖，并發生構象變化，降低了與半乳糖 操縱子識別序列結合的親和力。
[0011] 所述的環形單鏈模板DNA，是作為擴增模板用于滾環擴增的單鏈DNA，并含有半乳 糖阻遏蛋白的識別序列。
[0012] 所述的線性單鏈引物DNA，含有半乳糖阻遏蛋白的識別序列，該線性單鏈引物DNA 序列與環形單鏈模板DNA的序列堿基具有序列互補性，兩者形成的DNA雙鏈能夠被半乳糖 阻遏蛋白特異性地識別并結合。
[0013] 所述的DNA聚合酶是用于滾環擴增的DNA聚合酶。
[0014] 與傳統的HPLC、質譜、生物學等方法相比，本發明具有如下優點：
[0015] 1、操作簡單、步驟簡便；
[0016] 2、不需專業的大型儀器設備。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發明的流程圖；
[0018] 圖2是本發明檢測半乳糖的原理示意圖；
[0019] 圖3為本發明定量測定不同濃度半乳糖的實驗結果；
[0020] 圖4是本發明特異性鑒別半乳糖和其他14種單糖或二糖的實驗結果。
[0021] 圖2中，1、含有半乳糖阻遏蛋白識別序列的單鏈模板DNA;2、含有半乳糖阻遏蛋白 識別序列的線性單鏈引物DNA;3、DNA聚合酶；4、結合半乳糖的半乳糖阻遏蛋白；5、半乳糖； 6、未結合半乳糖的半乳糖阻遏蛋白。
[0022] 圖3是本發明定量測定不同濃度半乳糖的實驗結果。左圖：不同濃度的半乳糖的 滾環擴增反應的熒光時間曲線，其中X軸表示時間，y軸表示熒光強度；右圖：半乳糖濃度和 滾環擴增速率的線性關系，其中X軸表示半乳糖濃度，y軸表示滾環擴增速率。半乳糖濃度 單位μΜ表示微摩爾/升。
[0023]圖4是本發明特異性鑒別半乳糖和其他14種單糖或二糖的實驗結果。該柱狀圖 y軸表示相對滾環擴增速率。X軸表示14種待測糖類的名稱：半乳糖、木糖、核糖、脫氧核 糖、阿拉伯糖、巖藻糖、異丙基硫代半乳糖苷、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥 芽糖、密二糖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合附圖和實施例詳細描述本發明。
[0025] 本發明基于滾環擴增的半乳糖的檢測方法包括下述步驟：待檢測的半乳糖與半乳 糖阻遏蛋白結合，降低半乳糖阻遏蛋白對環形模板中識別序列的親和力，從環形單鏈模板 DNA與線性單鏈引物DNA形成的DNA雙鏈上脫落，進而解除DNA聚合酶對環形單鏈模板DNA 和線性單鏈引物DNA的擴增的抑制。滾環擴增的速率與半乳糖的濃度成正比，通過制備一 系列不同半乳糖濃度與相應滾環擴增速率的標準曲線，以及測定待測樣品對滾環擴增的速 率，可以分析出待測樣品中的半乳糖的濃度。該方法包括待檢測的半乳糖、半乳糖阻遏蛋 白、環形單鏈模板DNA、線性單鏈引物DNA、DNA聚合酶以及滾環擴增所需的酶反應體系。其 中，待檢測的半乳糖是半乳糖溶液。半乳糖阻遏蛋白是細菌產生的具有調控半乳糖操縱子 表達活性的半乳糖阻遏蛋白（GalR)。該蛋白可以特異的結合半乳糖，進而發生變構，降低對 半乳糖操縱子中識別序列的親和力。環形單鏈模板DNA，是作為擴增模板用于滾環擴增的環 形單鏈DNA，并含有半乳糖阻遏蛋白的特異識別序列。線性單鏈引物DNA，含有半乳糖阻遏 蛋白的特異識