人PLIN1基因rs2289487位點多態性檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及測定單核苷酸多態性的方法。
【背景技術】
[0002] SNP(單核苷酸多態性）是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式。基因多態性是個體與生倶來的遺傳特征，不隨環境發生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現，因此其應用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態性檢測在遺傳學領域和醫學領域中應用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進化等遺傳學現象。根據基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史， 闡明物種進化關系。應用于考古學中以確定古人類遺傳變異特征以及不同種群的親緣關 系。2.研究多態與種群未緣關系等遺傳學研究。多態亦與各種人體特征密切相關，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預防醫學領域可以用于疾病預防措施。通過研究人體 對毒物的耐受性，發現易于對某種毒物發生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸， 保護該易感人群。例如，對準備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態檢測，篩查出容易出 現血液毒性、神經毒性等反應的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過多態檢測可以判斷患病個體對某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效 果的反應程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004]PLIN1基因位于染色體15q26. 1，編碼的perilipin蛋白在脂肪代謝過程中起著重 要的作用。PLIN1基因rs2289487位點多態，在人群中存在兩種等位基因A和G，形成三種 PLIN1基因的基因型：AA型（人體基因組rs2289487多態位點的兩個等位基因堿基均為A)， AG型（人體基因組rs2289487多態位點的兩個等位基因堿基分別為A和G)和GG型（人體 基因組rs2289487多態位點的兩個等位基因堿基均為G)。
[0005] 聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態（PCR-RFLP)技術是一種快速、簡便、準 確、低成本測定SNP(單核苷酸多態性）基因型的經典方法。該方法通過引物來對模板進行 擴增反應，形成足夠數量和穩定的擴增產物，通過對擴增產物的酶切和檢測酶切產物的片 段長度，最終測定出SNP。PLIN1基因rs2289487多態位點采取PCR-RFLP技術進行檢測， 所需內切酶為BsmI內切酶，其價格較昂貴，需要開發新的檢測技術。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測定人PLIN1基因 rs2289487位點多態性的可靠手段。
[0007] 根據本發明的第一方面，提供了一種測定人PLIN1基因rs894160位點多態性的方 法，包括：
[0008] 提供待測人基因組DNA;
[0009] 提供擴增人PLIN1基因rs2289487位點附近序列的上游引物和下游引物，其中上 游引物具有錯配喊基c;
[0010] 以所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應以 獲得含CGCR片段或者TGCGCR片段的擴增產物，其中R為人PLIN1基因rs2289487位點上 的待定堿基A或G;
[0011] 提供限制性內切酶；
[0012] 利用限制性內切酶對所得擴增產物進行酶切（反應）以獲得相應的酶切產物；以 及
[0013] 根據所得酶切產物來確定人PLIN1基因rs2289487位點上的待定堿基R是A還是 G，
[0014] 其中，限制性內切酶為僅能夠切開CGCG片段與CGCA片段之一，或者TGCGCA片段 與TGCGCG片段之一的限制性內切酶。
[0015] 根據本發明的實施例，在所得擴增產物上，上游引物的錯配堿基C與R之間相隔兩 個堿基GC。令人驚訝的是，如此設置錯配堿基將使酶切反應進行得極其順利，不會出現酶切 不充分等現象。并且，如此設置上游引物錯配堿基使PCR反應進行順利，提高了PCR的靈敏 度和特異度，這可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結構改變有關。
[0016] 在本發明的一個可選實施例中，在所得擴增產物上，上游引物末端堿基與R相鄰。
[0017] 在本發明的一個優選實施例中，在所得擴增產物上，上游引物末端堿基不與R相 鄰。例如，上游引物末端可以是……GCG等結構。難以想象，具有這種設計的上游引物竟然 會進一步大大促進酶切反應，這可能與擴增結合力有某種關聯。
[0018] 在本發明的一個優選實施例中，限制性內切酶可以采用僅能切開CGCG片段的 BstUI或其同裂酶。這類BstUI酶價格低廉，能大大降低測定成本。
[0019] 根據本發明的實施例，所得酶切產物包括三種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴增產物、切斷后具有較長片段的擴增產物以及（通常不能有效觀測到的）切斷后具有 較短片段的擴增產物（通常不能有效觀測到的）。通過觀測（判斷）酶切產物所包含的片 段類型來確定人PLIN1基因rs2289487位點上的待定堿基是A還是G。例如，在采用BstUI 酶的情況下，根據總片段和切斷后較長片段這兩個片段的觀察結果來進行判斷：如果觀察 到酶切產物只有一種具有總片段長度的未切斷擴增產物，則待定堿基為A;如果觀察到酶 切產物只有一種具有較長片段（小于總片段長度）的切斷產物，則待定堿基為G;如果觀察 到上述二者，則待定堿基既包括A又包括G。
[0020] 在本發明的一個實施例中，判斷（或觀測）酶切產物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯合紫外燈拍照后與參照圖對比來進行的。這種情況下，優選參照圖是擴增產物在 凝膠電泳標準設定時間后經紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖 像位置，其中第一參照圖像位置針對的是未切斷的總片段長度的擴增產物，而第二參照圖 像位置則針對的是切斷后具有較長片段的擴增產物。例如，本發明采用的參照圖是由合成 的181bp和137bp兩個堿基片段同時經凝膠電泳相同時間后紫外燈拍照而成。與常規DNA ladder的復合參照圖相比，由于采用了僅具有兩個特定參照圖像位置的參照圖，本發明的 這種方法能夠直觀快速地觀測或判斷酶切產物所包含的片段類型，同時最大限度地避免了 誤判。酶切反應后，優選將酶切產物濃縮1~2倍濃度后進行電泳，增加圖像亮度，提高判 斷準確性。
[0021] 在本發明的優選實施例中，通過設計上游引物和下游引物的長度而使得擴增產物 的總片段長度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，優選長度40~ 60bp(在該優選區間擴增反應尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段長度 的百分比超過20%。本發明的這種設計可以使得具有總片段長度的未切斷擴增產物與切斷 后具有較長片段的擴增產物的電泳紫外照片的位置區別顯著。但是，如果總片段過長，則電 泳位移將不明顯；過短則圖像會變得模糊一片，無法準確區分。上游引物的片段長度范圍保 證了PCR擴增反應能夠順利進行，避免了錯配堿基時會出現的擴增不足現象。
[0022] 在本發明的優選實施例中，通過控制PCR擴增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優選溫度60~69°C(該溫度可提高擴增反應的特異性），使得設計的PCR產物純度 較高。本發明的這種設計可以使得PCR擴增產物條帶清楚，無雜帶出現，易于電泳識別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難以區分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產物過少，影響觀察效果。
[0023] 在本發明的優選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s 之間，優選時間15~30s(該時間可提高擴增反應的效率和擴增產物的特異性），使得設計 的PCR反應時間較短，擴增產物純度較高。本發明的這種設計可以使PCR擴增產物條帶清 楚，無雜帶出現，易于電泳識別，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶不能 完全擴增而使得擴增產物較少，電泳后難以區分判斷；如果時間過長，則增加非特異條帶的 出現幾率，出現雜帶影響觀察效果。
[0024] 在本發明中，PCR反應成分可以包含DNA模板、上下游引物、Taq DNA polymerase (DNA聚合酶或亦可稱作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發明的優選實施例 中，PCR擴增反應中可以使用Taq DNA polymerase(DNA聚合酶）及其Taq Antibody。Taq Antibody是Taq DNA polymerase的單克隆抗體，其與Taq DNA polymerase結合后抑制DNA 聚合酶活性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可以封閉Taq DNA polymerase的活 性，因此可以非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴增，具 有極高的擴增靈敏度和特異性。Champagne Taq Antibody只需要在95°C加熱30s即可完 全失活，釋放Taq DNA polymerase活性，保證了后續PCR擴增反應能夠順利進行。
[0025]PCR反應中可以加入pH值為8. 1~8. 7的Tris-HCl緩沖液，在72°C延伸反應時 調整PCR溶液pH值在6. 8~7. 8之間，從而使Taq酶在偏堿性環境中更好地發揮活性。另 外，PCR溶液中還可以加入明膠（0.01%)以減少PCR管對Taq酶的吸附作用，穩定酶活性 及保護作用，促進PCR反應。
[0026] 另外，PCR溶液中Mg2+濃度在1. 5~2. 0mmol/L之間時，可以很好地控制PCR反應 的產率和特異性。
[0027] PCR反應引物的終濃度一般為0. 1~1μΜ左右，濃度太高會導致非特異性擴增，太 低則擴增產物太少。
[0028] 此外，PCR反應中還可以加入助溶劑二甲亞砜（DMS0)和硫酸銨以降低堿基錯配水 平，提高富含GC模板的擴增效率。這可能與消除引物和模板的二級結構，降低DNA解鏈溫 度使DNA變性完全有關。
[0029] 根據本發明的另一方面，提供了一種用于測定人PLIN1基因rs2289487位點多態 性的試劑盒，其包含：
[0030] 用于PCR擴增人PLIN1基因rs2289487位點附近序列的上游引物和下游引物，其 中上游引物具有錯配堿基C以獲得含CGCR片段或者TGCGCR片段的擴增產物，其中R為人 PLIN1基因rs2289487位點上的待定堿基A或G;以及
[0031] 能夠切開CGCG